作者jesuislune (jesuiszoe)
看板Biotech
標題[求救] 冷凍切片乾裂問題
時間Mon Dec 23 10:33:08 2024
各位學長姐們好，我是趕著口試的碩三菸酒生，這邊有冷凍切片的問題想詢問，
我的sample為大鼠的坐骨神經，染GFAP(FITC)/MPZ(FarRed)
這邊先附上我每次進行實驗的protocol：
1. Sample取出後直接包埋在OCT (Thermo)後冰-20
2. 切片，切片後的片子會室溫陰乾後放在加熱板上烘片1小時
3. 先用PBS rinse一次，使用3% H2O2（溶在0.5% Triton X-100溶液中）打洞30分鐘
4. 用0.1% BSA blocking( in 0.5% Tritons X-100) 60分鐘
5. PBS rinse 後下一抗 GFAP/MPZ 1:500 4度C overnight （在保濕黑盒子）
6. 隔天再PBS rinse後二抗 FITC/FarRed 1:500 室溫 60分鐘 （在保濕黑盒子）
7. PBS rinse後用Mounting buffer with DAPI進行封片，染好的片子放保濕黑盒子4度C
保存
這是我實驗室傳下來的做法，每次實驗都follow這套，但這次Data被教授說是乾掉，
下方附上這次的data：
https://i.imgur.com/xQ1uFVS.jpeg
我上網查了一下在想會不會是我切完後沒有fix而是直接烘片導致的問題？但是第一次發
生這樣的情形，所以不太確定，希望能看看學長姐們的建議～
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1F：→ blence: 為什麼這裡沒有呈色卻還要用H2O2？ 12/28 13:06
2F：→ xxtomnyxx: H2O2應該是bleaching，去掉一些色素或酵素的活性 12/29 12:29
3F：→ xxtomnyxx: 我比較好奇的是，就我所知組織不是應該在包埋前就要fix 12/29 12:30
4F：→ xxtomnyxx: 嗎？你的老鼠有灌流？ 12/29 12:30
5F：推 tharaohfu: 我們的做法是切片完後一樣冰-20，開始染色前先放到-20 01/11 20:30
6F：→ tharaohfu: 度C的methanol，接著PBS wash再做block。 01/11 20:30