作者jesuislune (jesuiszoe)
看板Biotech
标题[求救] 冷冻切片乾裂问题
时间Mon Dec 23 10:33:08 2024
各位学长姐们好，我是赶着口试的硕三菸酒生，这边有冷冻切片的问题想询问，
我的sample为大鼠的坐骨神经，染GFAP(FITC)/MPZ(FarRed)
这边先附上我每次进行实验的protocol：
1. Sample取出後直接包埋在OCT (Thermo)後冰-20
2. 切片，切片後的片子会室温阴乾後放在加热板上烘片1小时
3. 先用PBS rinse一次，使用3% H2O2（溶在0.5% Triton X-100溶液中）打洞30分钟
4. 用0.1% BSA blocking( in 0.5% Tritons X-100) 60分钟
5. PBS rinse 後下一抗 GFAP/MPZ 1:500 4度C overnight （在保湿黑盒子）
6. 隔天再PBS rinse後二抗 FITC/FarRed 1:500 室温 60分钟 （在保湿黑盒子）
7. PBS rinse後用Mounting buffer with DAPI进行封片，染好的片子放保湿黑盒子4度C
保存
这是我实验室传下来的做法，每次实验都follow这套，但这次Data被教授说是乾掉，
下方附上这次的data：
https://i.imgur.com/xQ1uFVS.jpeg
我上网查了一下在想会不会是我切完後没有fix而是直接烘片导致的问题？但是第一次发
生这样的情形，所以不太确定，希望能看看学长姐们的建议～
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1F：→ blence: 为什麽这里没有呈色却还要用H2O2？ 12/28 13:06
2F：→ xxtomnyxx: H2O2应该是bleaching，去掉一些色素或酵素的活性 12/29 12:29
3F：→ xxtomnyxx: 我比较好奇的是，就我所知组织不是应该在包埋前就要fix 12/29 12:30
4F：→ xxtomnyxx: 吗？你的老鼠有灌流？ 12/29 12:30
5F：推 tharaohfu: 我们的做法是切片完後一样冰-20，开始染色前先放到-20 01/11 20:30
6F：→ tharaohfu: 度C的methanol，接着PBS wash再做block。 01/11 20:30