作者QuteMango (芒果是藍波萬)
看板Biotech
標題[求救] SDS-PAGE上膠會阻擋loading
時間Sat May 13 17:36:08 2023
各位好
我通常都是做完膠之後凝固overnight
但有時候會遇到上膠會形成一層薄膜
阻擋loading 導致sample沒辦法好好到well底部
甚至漂起來跑到隔壁well的情形
同時做好幾片膠 有的沒有這種情況有的就有
想請問各位有沒有遇過這類情形，都是怎麼解決的呢？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 39.12.2.166 (臺灣)
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1683970570.A.718.html
※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 17:36:53
1F：→ Bows: 你是不是拿到.75的comb05/13 18:57
沒有拿錯comb
但的確感覺像是comb兩側有一層薄薄的膠
tip下去的時候就會把它往下推 導致影響loading
不知道要怎麼避開這個問題QQ
2F：推 waveking: 製膠的Buffer pH值跑掉了，換掉就好了05/13 20:03
3F：→ xxtomnyxx: 這個問題沒有親眼看到倒底是怎麼個薄膜法，我覺得很難05/13 21:53
4F：→ xxtomnyxx: 除錯....05/13 21:54
今天跑膠的時候忘記拍起來了QQ
不過大概也只能看到Sample load不下去的樣子，薄膜應該看不清楚
5F：→ QuteMango: 沒有耶 確定是1.5mm的comb 用新訂的commercial buffer05/13 22:03
6F：→ QuteMango: 也是一樣有這個情況05/13 22:03
7F：→ QuteMango: 會是跟凝overnight 有關係嗎？05/13 22:03
※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 22:04:45
※ 編輯: QuteMango (39.12.2.166 臺灣), 05/13/2023 22:06:44
8F：→ Ice9: 凝膠時的保濕措施怎麼做的？05/14 00:04
沒有保濕耶 就放在bench上overnight
如果做完凝固後泡在running buffer隔日再使用可能會比較好嗎？
9F：推 dawnga: 用二次水噴瓶沖洗well有用嗎？05/14 10:39
不曉得欸 感覺有點難沖掉
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/14/2023 16:21:50
10F：→ xxtomnyxx: 沒有保濕，還直接放bench上，那大概是乾掉了05/14 16:23
11F：推 lemonteas: 不懂凝固為什麼要overnight? 這樣膠不就壞了嗎？ 05/15 10:28
12F：→ QuteMango: 之前實驗室是放overnight凝的比較好，我也有看到protoc05/15 15:18
13F：→ QuteMango: al是這樣做的。不過也有可能現在的實驗室都是24小時有05/15 15:18
14F：→ QuteMango: 空調，所以不適合這樣做。05/15 15:18
15F：推 leptoneta: 不就是殘膠嗎05/15 15:58
不確定您指的殘膠是如何？如果是指well兩側多的膠體 那應該就是QQ
16F：推 lemonteas: 我使用Bis-Tris gel，從4%到20%，都是15-20分鐘內會凝 05/15 18:10
17F：→ lemonteas: 膠，然後馬上可以跑。不知道是不是你使用的gel不同或是 05/15 18:10
18F：→ lemonteas: APS壞了，才會需要這麼長時間去凝固05/15 18:10
抱歉先前沒有提到 我是用Tris-Glycine的膠
應該不是APS壞掉，我都是配好後分裝冰-20，每個月都會換新的，而且不是不凝，只是和
樓下說的一樣，之前的實驗室教說overnight可以讓膠聚合的更好
19F：→ xxtomnyxx: 雖然很多Lab都是膠凝了就拿來跑，可是事實上要讓PAGE完05/15 18:25
20F：→ xxtomnyxx: 全polymerize最好放個overnight，我自己經驗的確放o/n05/15 18:26
21F：→ xxtomnyxx: 的膠跑起來會比較漂亮，但是這不是必要的，bis-tris的05/15 18:27
22F：→ xxtomnyxx: 膠因為pH的關係會比較快凝05/15 18:27
23F：→ xxtomnyxx: 要凝o/n需要注意不能讓stacking乾掉，可以在加完stack-05/15 18:29
24F：→ xxtomnyxx: ing gel以後加一層水、酒精或isopropanol，不建議用run05/15 18:29
25F：→ xxtomnyxx: buffer，stacking的pH和running buffer不一樣，泡runn-05/15 18:30
26F：→ xxtomnyxx: ing buffer會讓stacking gel的pH跑掉，然後還是需要用05/15 18:31
27F：→ xxtomnyxx: 保鮮膜或夾鏈袋把鑄膠臺包起來避免蒸發05/15 18:31
29F：→ xxtomnyxx: 這篇的 3.3 看一下 05/15 18:42
感謝您的建議 我晚點研究一下這篇文章
想請問您是在放齒梳後加酒精/異丙醇/水嗎？這樣不會直接流下去嗎（困惑）？
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:00:59
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:02:45
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/15/2023 19:05:38
30F：→ a90648: 我是下膠壓水凝O/N，上膠隔天要跑才做 05/15 19:29
31F：→ QuteMango: 這個方法好像也不錯，請問上膠凝多久呢？15-30分鐘？ 05/15 20:14
32F：推 CSFV: 上膠凝30分鐘左右即可 05/16 00:28
33F：→ CSFV: 我泡整塊的native gel (TBE buffer, 5% glycerol, acrylami05/16 00:28
34F：→ CSFV: de/bis=29:1)不時也會出現文中所述的薄膜，解決方法是把tip 05/16 00:28
35F：→ CSFV: 插到well最底部再load下去XD。至於SDS上膠倒是沒遇過這情況05/16 00:28
36F：→ CSFV: 個人覺得跟是否放過夜凝固沒有關係，但也想不出有什麼原因 05/16 00:30
37F：推 leptoneta: 不就只是多餘膠體阻礙樣品下沉嗎 拿個tip或針頭清掉 05/16 09:29
38F：→ a90648: 我上膠是凝30分鐘 05/16 10:51
39F：推 darrenyo: 看起來是殘膠的問題 通常好像都是comb的問題.. 之前換 05/16 17:59
40F：→ darrenyo: 了另一批comb之後就好了 然後如果有殘膠的話就拿針頭去 05/16 17:59
41F：→ darrenyo: 沖well把他沖掉 不過要小心不要吸到膠會吸破 05/16 17:59
好像也蠻有可能的，因為我總覺得不是膠體乾掉造成的，因為是在well寬的地方的兩側，
而且同時做的膠有的有有的沒有。
也感謝提過解決的方法，我下次試試看
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/16/2023 19:21:20
※ 編輯: QuteMango (39.12.18.13 臺灣), 05/16/2023 19:23:06
42F：→ blence: 上膠區域只有玻璃,com,跟配好的pre-mix,不是膠乾掉那會是? 05/16 20:52
43F：→ blence: 膠還是現做現用吧,1小時可以能做完的事,放O/N反而增加麻煩 05/16 20:52
44F：→ blence: 而且既然為了方便buffer都是買配好的了,不需浪費這時間 05/16 20:52
45F：→ blence: 至於美觀,像下膠的band會微笑,band寬窄不一,15個well前後 05/16 20:56
46F：→ blence: 兩個常跑不好,像這些常見的情況都不是做膠放不夠久的問題 05/16 20:58
47F：→ blence: 如果想跑得漂亮一點,加入sample的影響還是關鍵得多 05/16 21:01
48F：→ schmitt: 你的尺梳沒洗乾淨，有殘膠．DNA agarous gel 也一樣有 05/21 23:12