作者QuteMango (芒果是蓝波万)
看板Biotech
标题[求救] SDS-PAGE上胶会阻挡loading
时间Sat May 13 17:36:08 2023
各位好
我通常都是做完胶之後凝固overnight
但有时候会遇到上胶会形成一层薄膜
阻挡loading 导致sample没办法好好到well底部
甚至漂起来跑到隔壁well的情形
同时做好几片胶 有的没有这种情况有的就有
想请问各位有没有遇过这类情形，都是怎麽解决的呢？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 39.12.2.166 (台湾)
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※ 编辑: QuteMango (39.12.2.166 台湾), 05/13/2023 17:36:53
1F：→ Bows: 你是不是拿到.75的comb05/13 18:57
没有拿错comb
但的确感觉像是comb两侧有一层薄薄的胶
tip下去的时候就会把它往下推 导致影响loading
不知道要怎麽避开这个问题QQ
2F：推 waveking: 制胶的Buffer pH值跑掉了，换掉就好了05/13 20:03
3F：→ xxtomnyxx: 这个问题没有亲眼看到倒底是怎麽个薄膜法，我觉得很难05/13 21:53
4F：→ xxtomnyxx: 除错....05/13 21:54
今天跑胶的时候忘记拍起来了QQ
不过大概也只能看到Sample load不下去的样子，薄膜应该看不清楚
5F：→ QuteMango: 没有耶 确定是1.5mm的comb 用新订的commercial buffer05/13 22:03
6F：→ QuteMango: 也是一样有这个情况05/13 22:03
7F：→ QuteMango: 会是跟凝overnight 有关系吗？05/13 22:03
※ 编辑: QuteMango (39.12.2.166 台湾), 05/13/2023 22:04:45
※ 编辑: QuteMango (39.12.2.166 台湾), 05/13/2023 22:06:44
8F：→ Ice9: 凝胶时的保湿措施怎麽做的？05/14 00:04
没有保湿耶 就放在bench上overnight
如果做完凝固後泡在running buffer隔日再使用可能会比较好吗？
9F：推 dawnga: 用二次水喷瓶冲洗well有用吗？05/14 10:39
不晓得欸 感觉有点难冲掉
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/14/2023 16:21:50
10F：→ xxtomnyxx: 没有保湿，还直接放bench上，那大概是乾掉了05/14 16:23
11F：推 lemonteas: 不懂凝固为什麽要overnight? 这样胶不就坏了吗？ 05/15 10:28
12F：→ QuteMango: 之前实验室是放overnight凝的比较好，我也有看到protoc05/15 15:18
13F：→ QuteMango: al是这样做的。不过也有可能现在的实验室都是24小时有05/15 15:18
14F：→ QuteMango: 空调，所以不适合这样做。05/15 15:18
15F：推 leptoneta: 不就是残胶吗05/15 15:58
不确定您指的残胶是如何？如果是指well两侧多的胶体 那应该就是QQ
16F：推 lemonteas: 我使用Bis-Tris gel，从4%到20%，都是15-20分钟内会凝 05/15 18:10
17F：→ lemonteas: 胶，然後马上可以跑。不知道是不是你使用的gel不同或是 05/15 18:10
18F：→ lemonteas: APS坏了，才会需要这麽长时间去凝固05/15 18:10
抱歉先前没有提到 我是用Tris-Glycine的胶
应该不是APS坏掉，我都是配好後分装冰-20，每个月都会换新的，而且不是不凝，只是和
楼下说的一样，之前的实验室教说overnight可以让胶聚合的更好
19F：→ xxtomnyxx: 虽然很多Lab都是胶凝了就拿来跑，可是事实上要让PAGE完05/15 18:25
20F：→ xxtomnyxx: 全polymerize最好放个overnight，我自己经验的确放o/n05/15 18:26
21F：→ xxtomnyxx: 的胶跑起来会比较漂亮，但是这不是必要的，bis-tris的05/15 18:27
22F：→ xxtomnyxx: 胶因为pH的关系会比较快凝05/15 18:27
23F：→ xxtomnyxx: 要凝o/n需要注意不能让stacking乾掉，可以在加完stack-05/15 18:29
24F：→ xxtomnyxx: ing gel以後加一层水、酒精或isopropanol，不建议用run05/15 18:29
25F：→ xxtomnyxx: buffer，stacking的pH和running buffer不一样，泡runn-05/15 18:30
26F：→ xxtomnyxx: ing buffer会让stacking gel的pH跑掉，然後还是需要用05/15 18:31
27F：→ xxtomnyxx: 保鲜膜或夹链袋把铸胶台包起来避免蒸发05/15 18:31
29F：→ xxtomnyxx: 这篇的 3.3 看一下 05/15 18:42
感谢您的建议 我晚点研究一下这篇文章
想请问您是在放齿梳後加酒精/异丙醇/水吗？这样不会直接流下去吗（困惑）？
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/15/2023 19:00:59
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/15/2023 19:02:45
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/15/2023 19:05:38
30F：→ a90648: 我是下胶压水凝O/N，上胶隔天要跑才做 05/15 19:29
31F：→ QuteMango: 这个方法好像也不错，请问上胶凝多久呢？15-30分钟？ 05/15 20:14
32F：推 CSFV: 上胶凝30分钟左右即可 05/16 00:28
33F：→ CSFV: 我泡整块的native gel (TBE buffer, 5% glycerol, acrylami05/16 00:28
34F：→ CSFV: de/bis=29:1)不时也会出现文中所述的薄膜，解决方法是把tip 05/16 00:28
35F：→ CSFV: 插到well最底部再load下去XD。至於SDS上胶倒是没遇过这情况05/16 00:28
36F：→ CSFV: 个人觉得跟是否放过夜凝固没有关系，但也想不出有什麽原因 05/16 00:30
37F：推 leptoneta: 不就只是多余胶体阻碍样品下沉吗 拿个tip或针头清掉 05/16 09:29
38F：→ a90648: 我上胶是凝30分钟 05/16 10:51
39F：推 darrenyo: 看起来是残胶的问题 通常好像都是comb的问题.. 之前换 05/16 17:59
40F：→ darrenyo: 了另一批comb之後就好了 然後如果有残胶的话就拿针头去 05/16 17:59
41F：→ darrenyo: 冲well把他冲掉 不过要小心不要吸到胶会吸破 05/16 17:59
好像也蛮有可能的，因为我总觉得不是胶体乾掉造成的，因为是在well宽的地方的两侧，
而且同时做的胶有的有有的没有。
也感谢提过解决的方法，我下次试试看
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/16/2023 19:21:20
※ 编辑: QuteMango (39.12.18.13 台湾), 05/16/2023 19:23:06
42F：→ blence: 上胶区域只有玻璃,com,跟配好的pre-mix,不是胶乾掉那会是? 05/16 20:52
43F：→ blence: 胶还是现做现用吧,1小时可以能做完的事,放O/N反而增加麻烦 05/16 20:52
44F：→ blence: 而且既然为了方便buffer都是买配好的了,不需浪费这时间 05/16 20:52
45F：→ blence: 至於美观,像下胶的band会微笑,band宽窄不一,15个well前後 05/16 20:56
46F：→ blence: 两个常跑不好,像这些常见的情况都不是做胶放不够久的问题 05/16 20:58
47F：→ blence: 如果想跑得漂亮一点,加入sample的影响还是关键得多 05/16 21:01
48F：→ schmitt: 你的尺梳没洗乾净，有残胶．DNA agarous gel 也一样有 05/21 23:12