作者ntuiob110 (芸)
看板Biotech
標題[求救] colony PCR p不出insert
時間Wed Sep 7 18:22:06 2022
各位版友好，第一次發文，如果有什麼格式不合還煩請提醒，謝謝大家
我的plasmid是以Gibson Assembly 組合insert 跟 pUC 的vector，之前藍白篩有成功轉入E. coli XL1-blue，從其中抽plasmid出來，想再轉入 E. coli DH5A 跟BL21(DE3)分別做保存跟表達，以colony PCR快速篩選Transformation 菌盤上的菌卻一直無法得到目標基因。
colony PCR有以之前抽取所得plasmid另外做一個正控制組，有得到目標基因。
transformation的實驗流程如下：將competent cell置於冰上解凍，注入5% plasmid DNA後，震盪一秒、放在冰上5分鐘，再以42°C heat shock 30sec，塗到LB/Amp plate上養overnight。
（以上流程都是參考自competent cell廠商提供的protocol)
transformation時也有塗沒有plasmid的組別做為負控制組，也如預期沒有長菌落
目前個人覺得會是colony中的plasmid 沒有insert，之後會想同一colony 以目標基因的primer跟AmpR的primer去跑colony PCR驗證
不知道版友們有沒有什麼其他的建議？謝謝大家
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1F：推 jabari: 重做 09/07 20:07
2F：→ rebirth: PCR 有positive control and negative control? 如何判 09/07 21:09
3F：→ rebirth: 斷沒有insert？ 另外看敘述應該是plasmid transformatio 09/07 21:09
4F：→ rebirth: n. 有沒有考慮直接抽plasmid (DH5a)做RE check? 09/07 21:09
5F：→ blence: 為了保存或表達的re-transform會需要用colony-PCR來驗證真 09/07 21:23
6F：→ blence: 偽,那代表在XL1-blue階段做的colony-PCR就是錯的 09/07 21:24
7F：推 darrenyo: 我自己做的話, 會在藍白篩完再挑菌做colony pcr或者抽p 09/07 21:34
8F：→ darrenyo: lasmid digestion擇一, 有對的話再送一到兩個plasmid去 09/07 21:34
9F：→ darrenyo: 送定序確認, 定序對了之後re-transform照理說全部都會 09/07 21:34
10F：→ darrenyo: 是你要的plasmid不太會有別的, 就不太會特別去check了 09/07 21:34
11F：→ ntuiob110: 後來發現colony PCR NEB有專門的kit，我的colony PCR 09/07 22:03
12F：→ ntuiob110: 指的是直接勾菌落跟NEB Q5 High Fidelity DNA Polymer 09/07 22:03
13F：→ ntuiob110: ase 去跑PCR 09/07 22:03
14F：→ ntuiob110: 可能會試試RE去digest 從藍白篩那邊抽出來的plasmid 09/07 22:03
15F：→ ntuiob110: 是不是我預期的長度，謝謝樓上各位大神的指教了 09/07 22:03
16F：→ xxtomnyxx: 用 Q5 HF 做 colony PCR.....好闊的實驗室啊！ 09/07 22:31
17F：推 Ianthegood: q5極挑template neb的onetaq就便宜大碗 colony pcr常 09/08 03:47
18F：→ Ianthegood: 批不出來的原因是菌下太多 我會先在另一個plate上面 09/08 03:47
19F：→ Ianthegood: 捅一下把太多的菌抹掉再進mix 09/08 03:47
20F：推 Ianthegood: 如果一定要用hf taq做colony pcr 我建議phusion或是一 09/08 03:49
21F：→ Ianthegood: 個新東西叫repliqa toughmix 然後一開始要記得熱3分 09/08 03:49
22F：→ Ianthegood: 鐘破菌 09/08 03:49
23F：→ xxtomnyxx: 我也是投拿你之前抽的去切 RE 一票，然後想問問：你具 09/08 10:47
24F：→ xxtomnyxx: 體來說是拿了幾 ng 的 plasmid DNA 去 transform？長出 09/08 10:48
25F：→ xxtomnyxx: 的 colony 大概有多少？ 09/08 10:48
26F：→ a90648: 從藍白篩抽出來的開始確認吧，感覺那邊就錯了 09/08 13:19
27F：→ ntuiob110: 我是取795.85 ng的DNA去transformation，長出來的菌落 09/08 21:08
28F：→ ntuiob110: 約900多顆 09/08 21:09
29F：→ TrueTomny: 你的transform菌液是全部拿去塗盤還是只取部分？我如 09/08 22:51
30F：→ TrueTomny: 果拿純化的plasmid用你說的那個量做transform，菌會直 09/08 22:51
31F：→ TrueTomny: 接長成一片膜蓋滿整個盤子完全沒辦法算，只有長900多 09/08 22:51
32F：→ TrueTomny: 顆我覺得太少了，應該是有問題 09/08 22:51
33F：→ Ice9: Insert 多大？怎麼來的？ 09/09 11:11
34F：推 ysfang623: colony PCR很吃挑菌的手感，建議養液體過夜再取1ul進 10/03 22:40
35F：→ ysfang623: 行PCR 10/03 22:40