作者ntuiob110 (芸)
看板Biotech
标题[求救] colony PCR p不出insert
时间Wed Sep 7 18:22:06 2022
各位版友好，第一次发文，如果有什麽格式不合还烦请提醒，谢谢大家
我的plasmid是以Gibson Assembly 组合insert 跟 pUC 的vector，之前蓝白筛有成功转入E. coli XL1-blue，从其中抽plasmid出来，想再转入 E. coli DH5A 跟BL21(DE3)分别做保存跟表达，以colony PCR快速筛选Transformation 菌盘上的菌却一直无法得到目标基因。
colony PCR有以之前抽取所得plasmid另外做一个正控制组，有得到目标基因。
transformation的实验流程如下：将competent cell置於冰上解冻，注入5% plasmid DNA後，震荡一秒、放在冰上5分钟，再以42°C heat shock 30sec，涂到LB/Amp plate上养overnight。
（以上流程都是参考自competent cell厂商提供的protocol)
transformation时也有涂没有plasmid的组别做为负控制组，也如预期没有长菌落
目前个人觉得会是colony中的plasmid 没有insert，之後会想同一colony 以目标基因的primer跟AmpR的primer去跑colony PCR验证
不知道版友们有没有什麽其他的建议？谢谢大家
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1F：推 jabari: 重做 09/07 20:07
2F：→ rebirth: PCR 有positive control and negative control? 如何判 09/07 21:09
3F：→ rebirth: 断没有insert？ 另外看叙述应该是plasmid transformatio 09/07 21:09
4F：→ rebirth: n. 有没有考虑直接抽plasmid (DH5a)做RE check? 09/07 21:09
5F：→ blence: 为了保存或表达的re-transform会需要用colony-PCR来验证真 09/07 21:23
6F：→ blence: 伪,那代表在XL1-blue阶段做的colony-PCR就是错的 09/07 21:24
7F：推 darrenyo: 我自己做的话, 会在蓝白筛完再挑菌做colony pcr或者抽p 09/07 21:34
8F：→ darrenyo: lasmid digestion择一, 有对的话再送一到两个plasmid去 09/07 21:34
9F：→ darrenyo: 送定序确认, 定序对了之後re-transform照理说全部都会 09/07 21:34
10F：→ darrenyo: 是你要的plasmid不太会有别的, 就不太会特别去check了 09/07 21:34
11F：→ ntuiob110: 後来发现colony PCR NEB有专门的kit，我的colony PCR 09/07 22:03
12F：→ ntuiob110: 指的是直接勾菌落跟NEB Q5 High Fidelity DNA Polymer 09/07 22:03
13F：→ ntuiob110: ase 去跑PCR 09/07 22:03
14F：→ ntuiob110: 可能会试试RE去digest 从蓝白筛那边抽出来的plasmid 09/07 22:03
15F：→ ntuiob110: 是不是我预期的长度，谢谢楼上各位大神的指教了 09/07 22:03
16F：→ xxtomnyxx: 用 Q5 HF 做 colony PCR.....好阔的实验室啊！ 09/07 22:31
17F：推 Ianthegood: q5极挑template neb的onetaq就便宜大碗 colony pcr常 09/08 03:47
18F：→ Ianthegood: 批不出来的原因是菌下太多 我会先在另一个plate上面 09/08 03:47
19F：→ Ianthegood: 捅一下把太多的菌抹掉再进mix 09/08 03:47
20F：推 Ianthegood: 如果一定要用hf taq做colony pcr 我建议phusion或是一 09/08 03:49
21F：→ Ianthegood: 个新东西叫repliqa toughmix 然後一开始要记得热3分 09/08 03:49
22F：→ Ianthegood: 钟破菌 09/08 03:49
23F：→ xxtomnyxx: 我也是投拿你之前抽的去切 RE 一票，然後想问问：你具 09/08 10:47
24F：→ xxtomnyxx: 体来说是拿了几 ng 的 plasmid DNA 去 transform？长出 09/08 10:48
25F：→ xxtomnyxx: 的 colony 大概有多少？ 09/08 10:48
26F：→ a90648: 从蓝白筛抽出来的开始确认吧，感觉那边就错了 09/08 13:19
27F：→ ntuiob110: 我是取795.85 ng的DNA去transformation，长出来的菌落 09/08 21:08
28F：→ ntuiob110: 约900多颗 09/08 21:09
29F：→ TrueTomny: 你的transform菌液是全部拿去涂盘还是只取部分？我如 09/08 22:51
30F：→ TrueTomny: 果拿纯化的plasmid用你说的那个量做transform，菌会直 09/08 22:51
31F：→ TrueTomny: 接长成一片膜盖满整个盘子完全没办法算，只有长900多 09/08 22:51
32F：→ TrueTomny: 颗我觉得太少了，应该是有问题 09/08 22:51
33F：→ Ice9: Insert 多大？怎麽来的？ 09/09 11:11
34F：推 ysfang623: colony PCR很吃挑菌的手感，建议养液体过夜再取1ul进 10/03 22:40
35F：→ ysfang623: 行PCR 10/03 22:40