作者pent (有人試我的密碼，幹)
看板Biotech
標題[求救]設計同基因 老鼠和人 都要的QPCR primer
時間Tue Oct 19 00:24:05 2021
要設計在老鼠和人都能用在同一個gene的primer，
sample是老鼠的tail genomic DNA
目標是找出
基因轉殖鼠有無成功攜帶人的同一個基因，這是在轉殖鼠上
另外，需要在wildtype老鼠上也能p到它自己野生型，
老闆希望用qpcr去算插入基因的copy number
我從researchgate上找到的流程，如下
1) First take the sequence you need from database (NCBI...) in fasta format.
Take the same orthologous gene from rat, mouse and human.
2) Align them (nucleotide sequence) using MUSCLE
(
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ )
3) Take the conserved region/regions and design primers.
You can use IDT primer quest online software (
https://www.idtdna.com/pages ).
Test for primer dimers and haipins with oligoanalyzer tool (IDT).
4) Blast your primers in
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn
to be sure about specificity.
前兩步照著做，但我找到相似的區域後是用primer-blast找出primers
database選Genomes for selected organisms (primary reference assembly only)
Organism 除了 Homo Sapiens還加Mus mouse, genus (taxid:10088)
https://imgur.com/0ekjsDl
從primer-blast結果，人的部分 primer完全match。
老鼠有幾個mer不太合，
forward的3'端有倒數第5個不太合
reverse，是倒數第4個
我記得應該是最後三個match就有機會做出來(？)
但是結果只有人的有訊號
https://imgur.com/39QAfgO
PCR condition: 95 5min, 95 30sec, 58 15sec, 72 15sec, 72 5min; 40 cycles
板上有無人有做過此類實驗的經驗？
我是要把PCR condtion在做調整，還是primer設計哪裡有誤？
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https://tinyurl.com/4b99rnwc 尋找投資機會
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1F：→ Ice9: 小鼠的變異很靠3'端啊，你怎麼會覺得沒問題？甚至有三個變 10/19 00:54
2F：→ Ice9: 異的 10/19 00:54
3F：→ xxtomnyxx: 找出轉殖鼠有無攜帶人類基因？那為什麼要能同時放大老 10/19 02:55
4F：→ xxtomnyxx: 鼠的？這樣如果有產物你要怎麼分是放大到人類的還是老 10/19 02:55
5F：→ xxtomnyxx: 鼠的基因片段？ 10/19 02:55
6F：推 camphor0614: 有mismatch的primer需要更低的annealing溫度，PCR條 10/19 07:30
7F：→ camphor0614: 件58C 15sec夾不到就再降溫度，56C、54C、52C、50C 10/19 07:30
8F：推 camphor0614: 另一個方法則是重新設計Primer，盡量找完全match的， 10/19 07:41
9F：→ camphor0614: 再不然match最多只集中在5'端5個mer。 10/19 07:41
10F：推 taya1991: 目標是確認轉殖鼠有沒有目標人類基因………那你就設計夾 10/19 07:51
11F：→ taya1991: 那個基因的primer啊？人的DNA是...positive ctrl? 10/19 07:51
12F：→ blence: 別調整了,你的PCR結果已經說明這老鼠帶有人的轉植基因了 10/19 08:23
13F：→ pent: 我需要同樣可已看到老鼠wildtype的 10/19 09:11
※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:16:37
※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:18:00
14F：→ blence: primer在mismatch的位置設計成degenerate code 10/19 10:39
15F：→ xxtomnyxx: 我來做的話，如果可以找到 >20 bp 人類和老鼠完全相同 10/19 13:13
16F：→ xxtomnyxx: 且適合作為 primer 的序列，只需要一個這樣的區域設計 10/19 13:13
17F：→ xxtomnyxx: primer 1，然後人類和老鼠各設計一條 primer 2-1 和 p 10/19 13:13
18F：→ xxtomnyxx: rimer 2-2，且人類和老鼠的PCR產物大小不同可以跑膠分 10/19 13:13
19F：→ xxtomnyxx: 辨，以後GT就3條 primer 丟在一管一起做PCR，然後可以 10/19 13:13
20F：→ xxtomnyxx: 跑膠看出是M/M、H/M或是H/H。如果都找不到共同>20 bp 10/19 13:13
21F：→ xxtomnyxx: 可設計的序列，就直接設計2對primer分別做人類和老鼠 10/19 13:13
22F：→ xxtomnyxx: ，只要設計的夠好4條丟同一管做也不會有影響 10/19 13:13
23F：→ Ice9: 對了，不考慮加一個 positive control? 10/19 16:09
24F：推 agagy: 向樓上說的設計人鼠2組就好啦，為什麼要複雜化 10/19 22:52
25F：→ agagy: 不然就像另外2位說的，人鼠都能P到那你怎麼知道是人還是鼠? 10/19 22:53
26F：→ agagy: 要分出人鼠的話也要像xx說的那樣設計三條來配對吧 10/19 22:55
27F：推 gisk: 用qpcr去算插入基因的copy number ->成功拜託跟我說一聲 10/20 19:08
28F：→ xxtomnyxx: 我覺得我大概猜到你們想幹嘛了，之所以要設計人類老鼠 10/21 22:17
29F：→ xxtomnyxx: 都能做的 primer，是為了用WT老鼠本身帶有的2個allele 10/21 22:18
30F：→ xxtomnyxx: 去當做標準，然後用qPCR算TG數比WT多帶了幾個copy吧？ 10/21 22:19
31F：→ xxtomnyxx: 首先.....這種做法必須要保證primer在人類老鼠都有100% 10/21 22:20
32F：→ xxtomnyxx: 的序列，否則就會因為有mismatch造成放大效率不一，然 10/21 22:20
33F：→ xxtomnyxx: 後即使primer binding site序列完全一樣，人類老鼠PCR 10/21 22:21
34F：→ xxtomnyxx: 產物的序列不同也就有可能影響放大效率了，primer也不 10/21 22:22
35F：→ xxtomnyxx: 能用前幾樓提到的degenerate code去做。總之，只要你沒 10/21 22:22
36F：→ xxtomnyxx: 辦法在人類和老鼠上找到完全一樣的兩個可以設計primer 10/21 22:23
37F：→ xxtomnyxx: 的區域，那就不用想用這個方法去算copy number了 10/21 22:23
38F：→ pent: 感謝，有相關paper。 10/22 13:38
39F：推 kohinoor: 如果用三個引子就能p到野生型，兩個(ab)在插入片段的上 03/23 07:51
40F：→ kohinoor: 下游，一個在拆入片段中(c)。野生型是ab出來的片段，有 03/23 07:51
41F：→ kohinoor: 插入序列的是ac 讓ab和ac長度不同 03/23 07:51