作者pent (有人试我的密码，干)
看板Biotech
标题[求救]设计同基因 老鼠和人 都要的QPCR primer
时间Tue Oct 19 00:24:05 2021
要设计在老鼠和人都能用在同一个gene的primer，
sample是老鼠的tail genomic DNA
目标是找出
基因转殖鼠有无成功携带人的同一个基因，这是在转殖鼠上
另外，需要在wildtype老鼠上也能p到它自己野生型，
老板希望用qpcr去算插入基因的copy number
我从researchgate上找到的流程，如下
1) First take the sequence you need from database (NCBI...) in fasta format.
Take the same orthologous gene from rat, mouse and human.
2) Align them (nucleotide sequence) using MUSCLE
(
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ )
3) Take the conserved region/regions and design primers.
You can use IDT primer quest online software (
https://www.idtdna.com/pages ).
Test for primer dimers and haipins with oligoanalyzer tool (IDT).
4) Blast your primers in
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn
to be sure about specificity.
前两步照着做，但我找到相似的区域後是用primer-blast找出primers
database选Genomes for selected organisms (primary reference assembly only)
Organism 除了 Homo Sapiens还加Mus mouse, genus (taxid:10088)
https://imgur.com/0ekjsDl
从primer-blast结果，人的部分 primer完全match。
老鼠有几个mer不太合，
forward的3'端有倒数第5个不太合
reverse，是倒数第4个
我记得应该是最後三个match就有机会做出来(？)
但是结果只有人的有讯号
https://imgur.com/39QAfgO
PCR condition: 95 5min, 95 30sec, 58 15sec, 72 15sec, 72 5min; 40 cycles
板上有无人有做过此类实验的经验？
我是要把PCR condtion在做调整，还是primer设计哪里有误？
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1F：→ Ice9: 小鼠的变异很靠3'端啊，你怎麽会觉得没问题？甚至有三个变 10/19 00:54
2F：→ Ice9: 异的 10/19 00:54
3F：→ xxtomnyxx: 找出转殖鼠有无携带人类基因？那为什麽要能同时放大老 10/19 02:55
4F：→ xxtomnyxx: 鼠的？这样如果有产物你要怎麽分是放大到人类的还是老 10/19 02:55
5F：→ xxtomnyxx: 鼠的基因片段？ 10/19 02:55
6F：推 camphor0614: 有mismatch的primer需要更低的annealing温度，PCR条 10/19 07:30
7F：→ camphor0614: 件58C 15sec夹不到就再降温度，56C、54C、52C、50C 10/19 07:30
8F：推 camphor0614: 另一个方法则是重新设计Primer，尽量找完全match的， 10/19 07:41
9F：→ camphor0614: 再不然match最多只集中在5'端5个mer。 10/19 07:41
10F：推 taya1991: 目标是确认转殖鼠有没有目标人类基因………那你就设计夹 10/19 07:51
11F：→ taya1991: 那个基因的primer啊？人的DNA是...positive ctrl? 10/19 07:51
12F：→ blence: 别调整了,你的PCR结果已经说明这老鼠带有人的转植基因了 10/19 08:23
13F：→ pent: 我需要同样可已看到老鼠wildtype的 10/19 09:11
※ 编辑: pent (223.136.150.94 台湾), 10/19/2021 09:16:37
※ 编辑: pent (223.136.150.94 台湾), 10/19/2021 09:18:00
14F：→ blence: primer在mismatch的位置设计成degenerate code 10/19 10:39
15F：→ xxtomnyxx: 我来做的话，如果可以找到 >20 bp 人类和老鼠完全相同 10/19 13:13
16F：→ xxtomnyxx: 且适合作为 primer 的序列，只需要一个这样的区域设计 10/19 13:13
17F：→ xxtomnyxx: primer 1，然後人类和老鼠各设计一条 primer 2-1 和 p 10/19 13:13
18F：→ xxtomnyxx: rimer 2-2，且人类和老鼠的PCR产物大小不同可以跑胶分 10/19 13:13
19F：→ xxtomnyxx: 辨，以後GT就3条 primer 丢在一管一起做PCR，然後可以 10/19 13:13
20F：→ xxtomnyxx: 跑胶看出是M/M、H/M或是H/H。如果都找不到共同>20 bp 10/19 13:13
21F：→ xxtomnyxx: 可设计的序列，就直接设计2对primer分别做人类和老鼠 10/19 13:13
22F：→ xxtomnyxx: ，只要设计的够好4条丢同一管做也不会有影响 10/19 13:13
23F：→ Ice9: 对了，不考虑加一个 positive control? 10/19 16:09
24F：推 agagy: 向楼上说的设计人鼠2组就好啦，为什麽要复杂化 10/19 22:52
25F：→ agagy: 不然就像另外2位说的，人鼠都能P到那你怎麽知道是人还是鼠? 10/19 22:53
26F：→ agagy: 要分出人鼠的话也要像xx说的那样设计三条来配对吧 10/19 22:55
27F：推 gisk: 用qpcr去算插入基因的copy number ->成功拜托跟我说一声 10/20 19:08
28F：→ xxtomnyxx: 我觉得我大概猜到你们想干嘛了，之所以要设计人类老鼠 10/21 22:17
29F：→ xxtomnyxx: 都能做的 primer，是为了用WT老鼠本身带有的2个allele 10/21 22:18
30F：→ xxtomnyxx: 去当做标准，然後用qPCR算TG数比WT多带了几个copy吧？ 10/21 22:19
31F：→ xxtomnyxx: 首先.....这种做法必须要保证primer在人类老鼠都有100% 10/21 22:20
32F：→ xxtomnyxx: 的序列，否则就会因为有mismatch造成放大效率不一，然 10/21 22:20
33F：→ xxtomnyxx: 後即使primer binding site序列完全一样，人类老鼠PCR 10/21 22:21
34F：→ xxtomnyxx: 产物的序列不同也就有可能影响放大效率了，primer也不 10/21 22:22
35F：→ xxtomnyxx: 能用前几楼提到的degenerate code去做。总之，只要你没 10/21 22:22
36F：→ xxtomnyxx: 办法在人类和老鼠上找到完全一样的两个可以设计primer 10/21 22:23
37F：→ xxtomnyxx: 的区域，那就不用想用这个方法去算copy number了 10/21 22:23
38F：→ pent: 感谢，有相关paper。 10/22 13:38
39F：推 kohinoor: 如果用三个引子就能p到野生型，两个(ab)在插入片段的上 03/23 07:51
40F：→ kohinoor: 下游，一个在拆入片段中(c)。野生型是ab出来的片段，有 03/23 07:51
41F：→ kohinoor: 插入序列的是ac 让ab和ac长度不同 03/23 07:51