作者nm768417 (opport)
看板Biotech
標題[討論] 點突變如何成功
時間Tue Sep 14 15:18:04 2021
小弟使用PCR進行點突變
目標是改為下圖的大寫GCC
https://i.imgur.com/T3iWSFN.jpg
實驗流程是PCR進行點突變，利用設計好的兩個引子，會擴增出帶有目標區域的質體，接
著使用DpnI進行消化，消化掉帶有甲基化的質體股
PCR program：
95 蚓 5 mins
95 蚓 30 sec
55 蚓 30 sec 用的是CloneAmp HiFi premix
68 蚓 3 min 30 protocol提供的溫度參考
68 蚓 7 mins
25 蚓 1 mins
引子的黏合溫度 軟體是估60.6
不過學長覺得可能亂黏 就改成55了
引子當初設計的時候全長為26
Forward Reverse為互補
DpnI消化O/N
是由於引子長度太短導致黏不上嗎
還是TM值抓的太低
小弟能想到的只有這兩個可能性
最後都有去做定序
都沒有挑到成功的
希望各位高手大哥大姐們 多多指教
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1F：推 darrenyo: 問題是什麼? 菌不長? 挑出來不對? 還是根本沒P出東西09/14 16:25
2F：→ blence: 既然有學長就請學長來解決了09/14 17:25
3F：推 osla30: gcc是要改成什麼?用backtoback比較容易...09/14 21:04
※ 編輯: nm768417 (1.165.158.144 臺灣), 09/14/2021 23:50:52
4F：推 CSFV: annealing溫度調低一定接得上吧？倒是可能增加非特異性結合 09/15 00:33
5F：→ CSFV: 的機率，primer設計阿肥乍看之下沒什麼問題，硬要說的話3' 09/15 00:33
6F：→ CSFV: 那邊可以再少一個T，點突變兩側GC比例高一些會比較好接上去 09/15 00:33
7F：→ CSFV: 是說DpnI切O/N不會太久喔？現在幾乎都time-saving，15分鐘 09/15 00:33
8F：→ CSFV: 就搞定，阿肥頂多給他切到一個小時，切久好像容易出事 09/15 00:33
9F：→ Ice9: template上是GCC, 設計的 primer也是GCC。這是有改嗎？ 09/15 05:42
10F：→ CSFV: 我預設原po是不小心打錯，實際上有改XD 09/15 08:00
11F：→ nm768417: 應該說引子是GCC 所以模板預測出來是GCC 上面的圖片是 09/15 14:17
12F：→ nm768417: 成功後出來的預測結果 09/15 14:17
13F：推 osla30: 所以原本究竟是什麼？要改成GCC 09/16 00:12
14F：→ nm768417: 原本是R 09/16 11:49
15F：推 ad1980: 你的 vector 是 3.5kb？ 09/17 10:32
16F：推 bob79620: Dpn-1切O/N ？ 怪不得沒東西 09/20 23:49
17F：推 aeroufo: 左右邊各延長到17mers，Dpn-1切1小時就夠了 09/30 09:12
18F：→ Ice9: 可以考慮再繼續降到 52度試試。另外，原質體取自何種菌？新 10/01 17:55
19F：→ Ice9: 質體又用什麼菌？ 10/01 17:55