作者nm768417 (opport)
看板Biotech
标题[讨论] 点突变如何成功
时间Tue Sep 14 15:18:04 2021
小弟使用PCR进行点突变
目标是改为下图的大写GCC
https://i.imgur.com/T3iWSFN.jpg
实验流程是PCR进行点突变，利用设计好的两个引子，会扩增出带有目标区域的质体，接
着使用DpnI进行消化，消化掉带有甲基化的质体股
PCR program：
95 蚓 5 mins
95 蚓 30 sec
55 蚓 30 sec 用的是CloneAmp HiFi premix
68 蚓 3 min 30 protocol提供的温度参考
68 蚓 7 mins
25 蚓 1 mins
引子的黏合温度 软体是估60.6
不过学长觉得可能乱黏 就改成55了
引子当初设计的时候全长为26
Forward Reverse为互补
DpnI消化O/N
是由於引子长度太短导致黏不上吗
还是TM值抓的太低
小弟能想到的只有这两个可能性
最後都有去做定序
都没有挑到成功的
希望各位高手大哥大姐们 多多指教
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1F：推 darrenyo: 问题是什麽? 菌不长? 挑出来不对? 还是根本没P出东西09/14 16:25
2F：→ blence: 既然有学长就请学长来解决了09/14 17:25
3F：推 osla30: gcc是要改成什麽?用backtoback比较容易...09/14 21:04
※ 编辑: nm768417 (1.165.158.144 台湾), 09/14/2021 23:50:52
4F：推 CSFV: annealing温度调低一定接得上吧？倒是可能增加非特异性结合 09/15 00:33
5F：→ CSFV: 的机率，primer设计阿肥乍看之下没什麽问题，硬要说的话3' 09/15 00:33
6F：→ CSFV: 那边可以再少一个T，点突变两侧GC比例高一些会比较好接上去 09/15 00:33
7F：→ CSFV: 是说DpnI切O/N不会太久喔？现在几乎都time-saving，15分钟 09/15 00:33
8F：→ CSFV: 就搞定，阿肥顶多给他切到一个小时，切久好像容易出事 09/15 00:33
9F：→ Ice9: template上是GCC, 设计的 primer也是GCC。这是有改吗？ 09/15 05:42
10F：→ CSFV: 我预设原po是不小心打错，实际上有改XD 09/15 08:00
11F：→ nm768417: 应该说引子是GCC 所以模板预测出来是GCC 上面的图片是 09/15 14:17
12F：→ nm768417: 成功後出来的预测结果 09/15 14:17
13F：推 osla30: 所以原本究竟是什麽？要改成GCC 09/16 00:12
14F：→ nm768417: 原本是R 09/16 11:49
15F：推 ad1980: 你的 vector 是 3.5kb？ 09/17 10:32
16F：推 bob79620: Dpn-1切O/N ？ 怪不得没东西 09/20 23:49
17F：推 aeroufo: 左右边各延长到17mers，Dpn-1切1小时就够了 09/30 09:12
18F：→ Ice9: 可以考虑再继续降到 52度试试。另外，原质体取自何种菌？新 10/01 17:55
19F：→ Ice9: 质体又用什麽菌？ 10/01 17:55