作者AndrewsLiu (安德魯斯)
看板Biotech
標題[求救] Transformation失敗
時間Wed Sep 8 00:38:22 2021
小弟是才疏學淺的專題生
最近要送一個Vector4.5k Insert3.6k的質體
酵素是NEB的KpnI-HF以及XhoI
根據NEB的Double Digests推薦的protocol
酵素切1ug的DNA 37度15分鐘 跑膠確定有切完
ligation的部分比例是3:1 4度overnight
送進Stbl3勝任細胞
ligation product 5ul跟10ul都有試過
加入後按照stbl3 protocol 冰上30min
heat-shock 42度45sec 再冰上三分鐘
然後SOC 37度 recover 1hr
抗生素是用Kanamycin 塗盤卻只有一兩顆或是完全沒長
有一次check挑到一個clone有band
但是用Kna-LB養小量(20ul)一小時之後菌就消失了QQ
同儕也使用同一批勝任細胞送質體 長得很正常
請問各位大大ligation的部分還能怎麼改進嗎
如果有哪裡不對還請用力鞭
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.10.95.187 (臺灣)
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※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 00:49:00
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 01:23:14
1F：→ aeroufo: insert太長本來成功率就會低 09/08 09:11
我還有其他改善方法讓成功率更高嗎QQ
2F：→ blence: 猜同儕的質體或許不是用Kana 09/08 09:31
他的也是用Kna 而且我幫他transformation的 步驟完全一樣
3F：推 tynse71864: ligation 3:1 是insert 3嗎 09/08 12:19
是Insert3:Vector1 有在想要不要把Insert提高
※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:36:45
※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:37:35
4F：→ fishg1216: 比例可以試著調高至4：1至6：1,另外有試過insert用水 09/08 14:36
5F：→ fishg1216: 回溶嗎？不用elution buffer 09/08 14:36
那我試試看把Insert比例提高 感覺有點高估Insert的DNA量
另外我Insert都是用55度ddH2O回溶的
※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.157.21 臺灣), 09/08/2021 15:02:11
6F：推 Qaaaa: 可試試爆量insert DNA海戰術 09/08 19:30
這樣..真的可以嗎
7F：推 ampicillin: 你的比例是什麼東西的比例？ 09/08 20:02
Vector ng/kb : Insert ng/kb 是1:3
※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.156.99 臺灣), 09/08/2021 22:21:42
8F：→ xxtomnyxx: 切過的DNA有跑膠後切膠純化嗎？5和10 uL是反應總體積還 09/08 22:21
9F：→ xxtomnyxx: 是用來transform的體積？Ligation反應每20 uL中有多少 09/08 22:22
10F：→ xxtomnyxx: ng的DNA？ 09/08 22:22
5ul跟10ul是用來transformation的ligation product的量 20ul裡面大概會抓100ng DNA
InsertPCR後、Vector酵素切後都有切膠取 Insert的酵素切之後是直接clean up回收
11F：→ xxtomnyxx: 如果ligation的量夠多，可以拿vector、insert和ligatio 09/08 22:23
12F：→ xxtomnyxx: n產物去跑膠，vector和insert應該是單一band，而ligati 09/08 22:24
13F：→ xxtomnyxx: on產物則會有產生不同於vector和insert大小的band 09/08 22:24
前陣子實驗室安全染告急 有打算等安全染到了跑跑看！
14F：推 CSFV: 推insert海 暗黑大法 09/09 00:05
有成功的經驗嗎 瞞著師試試看..?
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:34:31
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:37:18
15F：推 alextu870719: insert用t4 pnk處理看看 09/09 01:44
16F：→ alextu870719: 喔看到用酵素切的 那就沒差了 09/09 01:46
17F：推 michaelhsien: 聽你的描述，感覺可以做看看ligation positive cont 09/09 12:51
18F：→ michaelhsien: rol 09/09 12:51
19F：推 fishg1216: 你加入ligation產物至勝任細胞混合是輕彈嗎？應該沒有 09/09 22:47
20F：→ fishg1216: pipetting吧？ 09/09 22:47
沒有pipetting哦 都是flip的
21F：→ fishg1216: vector是用那一種？同儕用的跟你一樣嗎？ 09/09 22:52
是一模一樣的vector
22F：→ fishg1216: 要不要試著單純塞空載體進去看看能不能work 09/09 22:53
23F：推 gnishta: 偏題想問一下 XhoI是rcutsmart buffer嗎？前陣子訂了XhoI 09/09 22:54
24F：→ gnishta: & PstI，兩個的包裝說明都說可以只要反應5-15分鐘，但Ps 09/09 22:54
25F：→ gnishta: tI給的buffer明明是舊款的3.1啊… 09/09 22:54
26F：→ blence: default配什麼buffer官網都寫得很清楚 09/09 23:02
27F：→ blence: NEB從buffer X變成X.1，現在又來rX.1,應該是想搞死自己 09/09 23:07
28F：推 tynse71864: Rx.1如果不能直接對應123真的會搞死人... 09/09 23:10
29F：→ blence: 還是另一牌的好用多了 09/09 23:13
30F：推 CSFV: 幾乎都有成功喔~老實說我都沒在管insert跟vector 比例，反 09/09 23:21
31F：→ CSFV: 正就是幹你娘塞爆，硬要算的話絕對都超過10：1，每次都是塞 09/09 23:21
32F：→ CSFV: 1.7kb的DNA進4.4kb的質體，屢試不爽，真心推薦 09/09 23:21
跟師討論之後這次打算把insert的量往上加加看 感謝建議QQ
33F：推 CSFV: 另外insert>2kb的話，建議recovery跟後續塗盤培養都在室溫 09/09 23:27
34F：→ CSFV: 就好(25-30°c)，溫度高的話細菌會把不喜歡的質體片段踢掉 09/09 23:27
可是照Kna半衰期來看應該大概16小時左右就會長雜菌了吧 這樣盤長得起來嗎
35F：→ xxtomnyxx: X.1 就只是在 X buffer 中加了BSA，rX.1 就是把 BSA 換 09/09 23:31
36F：→ xxtomnyxx: 成細菌製造的重組BSA，CutSmart就是 4 + BSA，完全不會 09/09 23:32
37F：→ xxtomnyxx: 混淆啊？ 09/09 23:33
38F：推 osla30: 用overlapping接法就好，很難失敗 09/10 07:38
39F：推 tynse71864: 另外我同意 CSFV的說法，基本上只要 vector有50-100ng 09/10 08:34
40F：→ tynse71864: , insert下到爆幾乎都會成功 09/10 08:34
41F：→ blence: 放那麼多vector的話mini不用挑很多顆? 有試過更少嗎? 09/10 11:30
42F：推 tynse71864: 試過更少(10-25)結果幾乎長不出來。50-100塗起來單一 09/10 15:15
43F：→ tynse71864: 菌落也非常好挑，就維持這個條件了 09/10 15:15
44F：→ tynse71864: btw家裡勝任細胞是買的所以很省，每次都用20ul菌來做, 09/10 15:17
45F：→ tynse71864: 這也是菌沒長太多的原因 09/10 15:17
46F：→ xxtomnyxx: 我做cloning 從來不用 ng 算，都用常數 0.0186 09/10 15:28
47F：→ xxtomnyxx: 話說，我熊熊想起來曾經遇過類似的狀況，雖然我用的是 09/10 15:32
48F：→ xxtomnyxx: DH5a，抗生素是amp，那次也是塗盤長很少顆，長的比較健 09/10 15:33
49F：→ xxtomnyxx: 康的colony做PCR都是空的，長得比較小的幾顆PCR才是有 09/10 15:34
50F：→ xxtomnyxx: 接insert進去的，但是養菌液也是幾個小時後就澄清然後 09/10 15:35
51F：→ xxtomnyxx: 長不出東西，後來除錯的結論是那段insert對細菌來說有 09/10 15:36
52F：→ xxtomnyxx: 毒，所以有接進去的都會長不好..... 09/10 15:37
其實現在做的是之前有完成的質體 只是定序之後發現綠螢光前面多兩個核甘酸 所以用
primer校正 所以insert應該是不會有太大問題的QQ
53F：→ blence: 我用50-100ng不只長太多,也增加挑到empty vector機率 09/10 16:02
54F：→ blence: 我們也用2,30ul買的台製勝任,10幾ng vector做ligation,取 09/10 16:02
55F：→ blence: 1/10去transform通常都長數十顆以上,不至於長不出來 09/10 16:03
56F：→ blence: 不過我們Amp plate只用40ug/ml可能算比較低的 09/10 16:06
57F：→ blence: 目前少到這樣的vector量,就能確保只挑一兩顆都會中 09/10 16:12
58F：推 FYT0429: kanamycin濃度降到25ug/ml 09/10 19:40
Kna濃度降低會比較好嗎 小弟我資質愚笨 不懂原理QQ
59F：推 tynse71864: B大, 我們也是台製細胞20ul左右；我其實試過amp 50ug/ 09/10 19:48
60F：→ tynse71864: ml但發現長出來太多雜菌了 (可能我養太久了吧科科),後 09/10 19:48
61F：→ tynse71864: 來就都用100了； 我一盤也是長大概10-20顆左右 09/10 19:48
62F：推 Ianthegood: 我最近感覺塞太大的東西進去會影響copy number... 原 09/10 20:16
63F：→ Ianthegood: 本pUC19用100 塞了一個8k的東西進去後就只能50了 09/10 20:16
64F：→ xxtomnyxx: 我家的勝任細胞是自製的，分裝一管50 uL，我最多1管拿 09/10 20:24
65F：→ xxtomnyxx: 來做5個tranasform，也就是只用10 uL勝任細胞，Ligatio 09/10 20:24
66F：→ xxtomnyxx: n產物加1~1.5 L，一般來說都會長幾百顆，vector contro 09/10 20:25
67F：→ xxtomnyxx: l通常 <10 顆，所以命中率可以有90%以上 09/10 20:25
68F：→ xxtomnyxx: Ligation產物加 1~1.5 uL......少寫個u 09/10 20:26
69F：→ blence: 買的勝任細胞不貴strain選擇也多,單管均價數十元,少挑2,3 09/10 23:45
70F：→ blence: 管mini或colonyPCR就能抵銷經費,畢竟命中率這麼高 09/10 23:46
71F：→ blence: 不過真是欽佩願意花時間自製又有這麼高的效率 09/10 23:49
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/11/2021 00:06:27
72F：推 CSFV: kana半衰期沒那麼短吧？我們泡完兩三個禮拜都還堪用欸， 09/11 08:59
73F：→ CSFV: 濃度50 microgram/ml。倒是amp半衰期就很快，大概泡完超過 09/11 08:59
74F：→ CSFV: 三天我就當作他沒加過，用之前再塗上200 microgram/ml的量 09/11 08:59
75F：→ CSFV: 抗生素濃度太低的話，反而質體收不到刺激，複製效果會很差 09/11 09:01
76F：推 FYT0429: 在transformation時kanamycin降低濃度菌比較好長，後續li 09/11 11:48
77F：→ FYT0429: quid culture會再提高到50 ug/ml 09/11 11:48
78F：推 chungrew: 你怎不問Lab的前輩？ 09/11 17:42
79F：推 tynse71864: kana盤放三個月都還能用吧 amp我一個月就丟了 09/11 20:24
80F：推 datro: Kan超耐 幾乎都不用考慮雜菌問題! 只有兩個mer insert要去 09/11 22:01
81F：→ datro: 掉 改inframe 不考慮直接用site-direct 去掉? 09/11 22:01
82F：→ hitmd: 直接用site-direct kit最乾脆 09/11 23:14
83F：推 qumai: Ligation 產物不要加超過competent cell體積的5% 09/13 15:03
84F：→ qumai: Ligation 試試16度 overnight, vector可以切多一點回溶體積 09/13 15:05
85F：→ qumai: 小一點提高濃度, Kanamycin濃度降低會長出更多colony 09/13 15:06
86F：推 nm768417: 好想知道你是誰 09/14 14:48
87F：推 suffy: Transformation完要先用不含抗生素的LB broth recover 30- 09/20 07:46
88F：→ suffy: 60min後再塗盤(+Kan), 不然菌裡面的Kan-resistant gene還 09/20 07:46
89F：→ suffy: 來不及表達就被殺死了 09/20 07:46
90F：推 Ice9: 我們家習慣跑膠放最後。Insert DNA在 PCR過後先回收、酵素 09/27 07:39
91F：→ Ice9: 切過再跑膠並clean up。 09/27 07:39
92F：→ nicerubytomo: ligation溫度如果是用T4 DNA ligase接應該用16度ove 02/09 16:10
93F：→ nicerubytomo: 16度overnight 02/09 16:10
94F：→ hohotest: 呼叫阿吉 11/08 23:46