作者AndrewsLiu (安德鲁斯)
看板Biotech
标题[求救] Transformation失败
时间Wed Sep 8 00:38:22 2021
小弟是才疏学浅的专题生
最近要送一个Vector4.5k Insert3.6k的质体
酵素是NEB的KpnI-HF以及XhoI
根据NEB的Double Digests推荐的protocol
酵素切1ug的DNA 37度15分钟 跑胶确定有切完
ligation的部分比例是3:1 4度overnight
送进Stbl3胜任细胞
ligation product 5ul跟10ul都有试过
加入後按照stbl3 protocol 冰上30min
heat-shock 42度45sec 再冰上三分钟
然後SOC 37度 recover 1hr
抗生素是用Kanamycin 涂盘却只有一两颗或是完全没长
有一次check挑到一个clone有band
但是用Kna-LB养小量(20ul)一小时之後菌就消失了QQ
同侪也使用同一批胜任细胞送质体 长得很正常
请问各位大大ligation的部分还能怎麽改进吗
如果有哪里不对还请用力鞭
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 101.10.95.187 (台湾)
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※ 编辑: AndrewsLiu (101.10.95.187 台湾), 09/08/2021 00:49:00
※ 编辑: AndrewsLiu (101.10.95.187 台湾), 09/08/2021 01:23:14
1F：→ aeroufo: insert太长本来成功率就会低 09/08 09:11
我还有其他改善方法让成功率更高吗QQ
2F：→ blence: 猜同侪的质体或许不是用Kana 09/08 09:31
他的也是用Kna 而且我帮他transformation的 步骤完全一样
3F：推 tynse71864: ligation 3:1 是insert 3吗 09/08 12:19
是Insert3:Vector1 有在想要不要把Insert提高
※ 编辑: AndrewsLiu (60.251.229.159 台湾), 09/08/2021 13:36:45
※ 编辑: AndrewsLiu (60.251.229.159 台湾), 09/08/2021 13:37:35
4F：→ fishg1216: 比例可以试着调高至4：1至6：1,另外有试过insert用水 09/08 14:36
5F：→ fishg1216: 回溶吗？不用elution buffer 09/08 14:36
那我试试看把Insert比例提高 感觉有点高估Insert的DNA量
另外我Insert都是用55度ddH2O回溶的
※ 编辑: AndrewsLiu (59.124.157.21 台湾), 09/08/2021 15:02:11
6F：推 Qaaaa: 可试试爆量insert DNA海战术 09/08 19:30
这样..真的可以吗
7F：推 ampicillin: 你的比例是什麽东西的比例？ 09/08 20:02
Vector ng/kb : Insert ng/kb 是1:3
※ 编辑: AndrewsLiu (59.124.156.99 台湾), 09/08/2021 22:21:42
8F：→ xxtomnyxx: 切过的DNA有跑胶後切胶纯化吗？5和10 uL是反应总体积还 09/08 22:21
9F：→ xxtomnyxx: 是用来transform的体积？Ligation反应每20 uL中有多少 09/08 22:22
10F：→ xxtomnyxx: ng的DNA？ 09/08 22:22
5ul跟10ul是用来transformation的ligation product的量 20ul里面大概会抓100ng DNA
InsertPCR後、Vector酵素切後都有切胶取 Insert的酵素切之後是直接clean up回收
11F：→ xxtomnyxx: 如果ligation的量够多，可以拿vector、insert和ligatio 09/08 22:23
12F：→ xxtomnyxx: n产物去跑胶，vector和insert应该是单一band，而ligati 09/08 22:24
13F：→ xxtomnyxx: on产物则会有产生不同於vector和insert大小的band 09/08 22:24
前阵子实验室安全染告急 有打算等安全染到了跑跑看！
14F：推 CSFV: 推insert海 暗黑大法 09/09 00:05
有成功的经验吗 瞒着师试试看..?
※ 编辑: AndrewsLiu (101.10.95.187 台湾), 09/09/2021 00:34:31
※ 编辑: AndrewsLiu (101.10.95.187 台湾), 09/09/2021 00:37:18
15F：推 alextu870719: insert用t4 pnk处理看看 09/09 01:44
16F：→ alextu870719: 喔看到用酵素切的 那就没差了 09/09 01:46
17F：推 michaelhsien: 听你的描述，感觉可以做看看ligation positive cont 09/09 12:51
18F：→ michaelhsien: rol 09/09 12:51
19F：推 fishg1216: 你加入ligation产物至胜任细胞混合是轻弹吗？应该没有 09/09 22:47
20F：→ fishg1216: pipetting吧？ 09/09 22:47
没有pipetting哦 都是flip的
21F：→ fishg1216: vector是用那一种？同侪用的跟你一样吗？ 09/09 22:52
是一模一样的vector
22F：→ fishg1216: 要不要试着单纯塞空载体进去看看能不能work 09/09 22:53
23F：推 gnishta: 偏题想问一下 XhoI是rcutsmart buffer吗？前阵子订了XhoI 09/09 22:54
24F：→ gnishta: & PstI，两个的包装说明都说可以只要反应5-15分钟，但Ps 09/09 22:54
25F：→ gnishta: tI给的buffer明明是旧款的3.1啊… 09/09 22:54
26F：→ blence: default配什麽buffer官网都写得很清楚 09/09 23:02
27F：→ blence: NEB从buffer X变成X.1，现在又来rX.1,应该是想搞死自己 09/09 23:07
28F：推 tynse71864: Rx.1如果不能直接对应123真的会搞死人... 09/09 23:10
29F：→ blence: 还是另一牌的好用多了 09/09 23:13
30F：推 CSFV: 几乎都有成功喔~老实说我都没在管insert跟vector 比例，反 09/09 23:21
31F：→ CSFV: 正就是干你娘塞爆，硬要算的话绝对都超过10：1，每次都是塞 09/09 23:21
32F：→ CSFV: 1.7kb的DNA进4.4kb的质体，屡试不爽，真心推荐 09/09 23:21
跟师讨论之後这次打算把insert的量往上加加看 感谢建议QQ
33F：推 CSFV: 另外insert>2kb的话，建议recovery跟後续涂盘培养都在室温 09/09 23:27
34F：→ CSFV: 就好(25-30°c)，温度高的话细菌会把不喜欢的质体片段踢掉 09/09 23:27
可是照Kna半衰期来看应该大概16小时左右就会长杂菌了吧 这样盘长得起来吗
35F：→ xxtomnyxx: X.1 就只是在 X buffer 中加了BSA，rX.1 就是把 BSA 换 09/09 23:31
36F：→ xxtomnyxx: 成细菌制造的重组BSA，CutSmart就是 4 + BSA，完全不会 09/09 23:32
37F：→ xxtomnyxx: 混淆啊？ 09/09 23:33
38F：推 osla30: 用overlapping接法就好，很难失败 09/10 07:38
39F：推 tynse71864: 另外我同意 CSFV的说法，基本上只要 vector有50-100ng 09/10 08:34
40F：→ tynse71864: , insert下到爆几乎都会成功 09/10 08:34
41F：→ blence: 放那麽多vector的话mini不用挑很多颗? 有试过更少吗? 09/10 11:30
42F：推 tynse71864: 试过更少(10-25)结果几乎长不出来。50-100涂起来单一 09/10 15:15
43F：→ tynse71864: 菌落也非常好挑，就维持这个条件了 09/10 15:15
44F：→ tynse71864: btw家里胜任细胞是买的所以很省，每次都用20ul菌来做, 09/10 15:17
45F：→ tynse71864: 这也是菌没长太多的原因 09/10 15:17
46F：→ xxtomnyxx: 我做cloning 从来不用 ng 算，都用常数 0.0186 09/10 15:28
47F：→ xxtomnyxx: 话说，我熊熊想起来曾经遇过类似的状况，虽然我用的是 09/10 15:32
48F：→ xxtomnyxx: DH5a，抗生素是amp，那次也是涂盘长很少颗，长的比较健 09/10 15:33
49F：→ xxtomnyxx: 康的colony做PCR都是空的，长得比较小的几颗PCR才是有 09/10 15:34
50F：→ xxtomnyxx: 接insert进去的，但是养菌液也是几个小时後就澄清然後 09/10 15:35
51F：→ xxtomnyxx: 长不出东西，後来除错的结论是那段insert对细菌来说有 09/10 15:36
52F：→ xxtomnyxx: 毒，所以有接进去的都会长不好..... 09/10 15:37
其实现在做的是之前有完成的质体 只是定序之後发现绿萤光前面多两个核甘酸 所以用
primer校正 所以insert应该是不会有太大问题的QQ
53F：→ blence: 我用50-100ng不只长太多,也增加挑到empty vector机率 09/10 16:02
54F：→ blence: 我们也用2,30ul买的台制胜任,10几ng vector做ligation,取 09/10 16:02
55F：→ blence: 1/10去transform通常都长数十颗以上,不至於长不出来 09/10 16:03
56F：→ blence: 不过我们Amp plate只用40ug/ml可能算比较低的 09/10 16:06
57F：→ blence: 目前少到这样的vector量,就能确保只挑一两颗都会中 09/10 16:12
58F：推 FYT0429: kanamycin浓度降到25ug/ml 09/10 19:40
Kna浓度降低会比较好吗 小弟我资质愚笨 不懂原理QQ
59F：推 tynse71864: B大, 我们也是台制细胞20ul左右；我其实试过amp 50ug/ 09/10 19:48
60F：→ tynse71864: ml但发现长出来太多杂菌了 (可能我养太久了吧科科),後 09/10 19:48
61F：→ tynse71864: 来就都用100了； 我一盘也是长大概10-20颗左右 09/10 19:48
62F：推 Ianthegood: 我最近感觉塞太大的东西进去会影响copy number... 原 09/10 20:16
63F：→ Ianthegood: 本pUC19用100 塞了一个8k的东西进去後就只能50了 09/10 20:16
64F：→ xxtomnyxx: 我家的胜任细胞是自制的，分装一管50 uL，我最多1管拿 09/10 20:24
65F：→ xxtomnyxx: 来做5个tranasform，也就是只用10 uL胜任细胞，Ligatio 09/10 20:24
66F：→ xxtomnyxx: n产物加1~1.5 L，一般来说都会长几百颗，vector contro 09/10 20:25
67F：→ xxtomnyxx: l通常 <10 颗，所以命中率可以有90%以上 09/10 20:25
68F：→ xxtomnyxx: Ligation产物加 1~1.5 uL......少写个u 09/10 20:26
69F：→ blence: 买的胜任细胞不贵strain选择也多,单管均价数十元,少挑2,3 09/10 23:45
70F：→ blence: 管mini或colonyPCR就能抵销经费,毕竟命中率这麽高 09/10 23:46
71F：→ blence: 不过真是钦佩愿意花时间自制又有这麽高的效率 09/10 23:49
※ 编辑: AndrewsLiu (101.10.95.187 台湾), 09/11/2021 00:06:27
72F：推 CSFV: kana半衰期没那麽短吧？我们泡完两三个礼拜都还堪用欸， 09/11 08:59
73F：→ CSFV: 浓度50 microgram/ml。倒是amp半衰期就很快，大概泡完超过 09/11 08:59
74F：→ CSFV: 三天我就当作他没加过，用之前再涂上200 microgram/ml的量 09/11 08:59
75F：→ CSFV: 抗生素浓度太低的话，反而质体收不到刺激，复制效果会很差 09/11 09:01
76F：推 FYT0429: 在transformation时kanamycin降低浓度菌比较好长，後续li 09/11 11:48
77F：→ FYT0429: quid culture会再提高到50 ug/ml 09/11 11:48
78F：推 chungrew: 你怎不问Lab的前辈？ 09/11 17:42
79F：推 tynse71864: kana盘放三个月都还能用吧 amp我一个月就丢了 09/11 20:24
80F：推 datro: Kan超耐 几乎都不用考虑杂菌问题! 只有两个mer insert要去 09/11 22:01
81F：→ datro: 掉 改inframe 不考虑直接用site-direct 去掉? 09/11 22:01
82F：→ hitmd: 直接用site-direct kit最乾脆 09/11 23:14
83F：推 qumai: Ligation 产物不要加超过competent cell体积的5% 09/13 15:03
84F：→ qumai: Ligation 试试16度 overnight, vector可以切多一点回溶体积 09/13 15:05
85F：→ qumai: 小一点提高浓度, Kanamycin浓度降低会长出更多colony 09/13 15:06
86F：推 nm768417: 好想知道你是谁 09/14 14:48
87F：推 suffy: Transformation完要先用不含抗生素的LB broth recover 30- 09/20 07:46
88F：→ suffy: 60min後再涂盘(+Kan), 不然菌里面的Kan-resistant gene还 09/20 07:46
89F：→ suffy: 来不及表达就被杀死了 09/20 07:46
90F：推 Ice9: 我们家习惯跑胶放最後。Insert DNA在 PCR过後先回收、酵素 09/27 07:39
91F：→ Ice9: 切过再跑胶并clean up。 09/27 07:39
92F：→ nicerubytomo: ligation温度如果是用T4 DNA ligase接应该用16度ove 02/09 16:10
93F：→ nicerubytomo: 16度overnight 02/09 16:10
94F：→ hohotest: 呼叫阿吉 11/08 23:46