作者dawnga (Dawn)
看板Biotech
標題[求救] 免疫沉澱（IP)問題
時間Sat Aug 21 12:41:28 2021
前輩好
最近要做IP後跑western ，實驗室以往沒有做過沒有人可以詢問，所以研究有些吃力，研
究許多protocol 後，有問題幾個問題想請教前輩。
先簡要敘述步驟：
蛋白定量後的樣品與（1.適量一抗）混合overnight,隔天加入活化後beads 約兩小時抓下
抗原抗體，（2.清洗）後離心留下沈澱物，加入（3.sample dye) 30uL，加熱95度/5分鐘
，完成。
請問前輩
1. 適量一抗一般標準是多少，第一次做該如何決定？
2. wash 沈澱物步驟，實驗室beads的datasheet 中寫「water」，我覺得有些奇怪，也有
看過中文論文以RIPA buffer 及 wash buffer ，不知何者較常見？
3.沈澱物加入30uL sample dye，所有的中英protocol 都這樣寫。我有一些疑問,以下有
四：
a. 所以sample 最後只有30uL 嗎？！ 這樣不是很濃嗎！跟先前定量的感覺也沒有關聯呀
？
b. 之後跑western 膠要load多少量呢？
c. Beads 是不是也在dye裡 ，也會被load進去嗎......
d. sample dye(6X) 應該要先稀釋成1X再加入30uL 嗎？
先謝謝前輩指教了！
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.217.136.33 (臺灣)
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1F：推 soend: 實驗室之前有做過western嗎？08/21 19:53
2F：推 soend: 如果沒有，建議你先研究western 的原理，IP只是樣本前處理 08/21 19:55
3F：→ soend: 不同而已
有做過，我會再多了解！
08/21 19:55
4F：推 CSFV: 珠珠load進去沒關係，會卡在well裡面，不會跑進膠裡面08/21 21:52
5F：→ CSFV: 之前做完IP要拿去打質譜前是這樣弄的
好的！了解 謝謝
08/21 21:52
6F：→ blence: IP抗體用量看datasheet,或參考abcam "Unpurified antibody08/22 14:43
7F：→ blence: concentrations"有相關的用量介紹08/22 14:43
8F：→ blence: 原則上wash會是PBS不是水,通常是當初用的lysis buffer或去08/22 14:43
9F：→ blence: 除detergent成分的buffer等,像是CSK buffer08/22 14:44
10F：→ blence: RIPA不適合在coIP或一般IP當wash buffer使用08/22 14:45
11F：→ blence: 多數IP能抓的是原本lysate的10~20%的蛋白,太多sample dye08/22 14:56
12F：→ blence: 沒必要,以30ul來說,剛好可以跑1次膠跟保留1次repeat機會08/22 14:58
謝謝您的詳細解說，跟您確認一下我的理解是否正確！ 所以我原先認為只有30uL會有很
濃度蛋白是不對的想法，因為IP後的蛋白可能剩不到兩成，所以跑膠時load量仍跟平常差
不多（10uL/well)嗎
※ 編輯: dawnga (49.217.3.144 臺灣), 08/22/2021 16:16:45
13F：推 soend: 建議跑IP之前，先測試該細胞裡你想要抓的蛋白的表現量，這 08/22 22:54
14F：→ soend: 樣才有辦法決定你要下多少蛋白量去抓。一抗要買有標可以IP 08/22 22:54
15F：→ soend: 的抗體，濃度可以先參照上面寫的。至於要loading 多少量，08/22 22:54
16F：→ soend: 也是參照表現量而定。就像前面說的，可以抓下來的量可能很08/22 22:54
17F：→ soend: 少，你如果還loading很少，可能也無法被偵測到。假設protoc08/22 22:54
18F：→ soend: ol 是建議用30ul去煮，通常就是全部loading 進去（使用大08/22 22:54
19F：→ soend: 的well),你說的10ul/well,應該是小的well 08/22 22:54
謝謝！！我這幾天很忙碌沒有時間回覆，感謝你的幫助，我有成功哦
20F：推 tynse71864: 1. 一般第一次我會用 1ug 抗體去抓 沒濃度的話用 1ul08/25 11:35
21F：→ tynse71864: 2. 我一般用 2x sample elution , 效果會比一倍的好 (08/25 11:35
22F：→ tynse71864: 我同學也有人用 5X的，只是很難 pipet)08/25 11:35
謝謝！我跟您一樣使用兩倍所以成功了，但是請教一下，一倍效果不好會看到什麼狀況嗎
？
23F：→ blence: bead體積殘餘的wash buffer不管再怎麼處理都不能完全去除 08/25 14:34
24F：→ blence: 所以放1x elution一定會稀釋,效果想必不好 08/25 14:35
了解了 謝謝您～
25F：→ xxtomnyxx: 抗體用量建議做個titration，bead其實有一種filter08/25 19:21
26F：→ xxtomnyxx: column可以把elution buffer 和 bead 分開，通常加了多 08/25 19:22
27F：→ xxtomnyxx: 少bead我就當作他體積有多少(就算是slurry也一樣)，然 08/25 19:23
28F：→ xxtomnyxx: 後用那個體積去回推要加幾倍的sample buffer。 08/25 19:23
29F：→ xxtomnyxx: Wash buffer要用什麼其實很不一定，看你實驗的目的決定 08/25 19:24
30F：→ xxtomnyxx: ，如果你只是要抓target protein，wash可以用比lysis08/25 19:25
31F：→ xxtomnyxx: buffer更強的(如NaCl濃度提高)去洗，但是如果你是要抓 08/25 19:25
32F：→ xxtomnyxx: 其他和target protein在一起的蛋白質(也就是其實是做 08/25 19:26
33F：→ xxtomnyxx: co-IP)，通常就是直接用lysis buffer去洗，而且lysis08/25 19:26
34F：→ xxtomnyxx: buffer不會用到RIPA，通常是用triton或NP40這類不會破08/25 19:27
35F：→ xxtomnyxx: 壞蛋白質構型的兩性分子配製lysis buffer。 08/25 19:28
謝謝您的詳細說明～這幾天有點忙沒有時間回覆，非常感謝你的幫助，我有成功哦，而且
得到了很多小知識，這個實驗室只有我一個人，所以在學習上有些辛苦（汗
36F：→ ad1980: 同前面推文說的，通常是用之前的 lysis buffer 洗，然後 3 08/31 23:30
37F：→ ad1980: 0 ul beads 我是用 30 ul 2X sample buffer，煮了以後 spi08/31 23:30
38F：→ ad1980: n down beads，如果不想 load beads 到 wells 裡，可以用08/31 23:30
39F：→ ad1980: 細長的那種 gel loading tips。08/31 23:30
謝謝你的說明，很詳細讓我完全了解，不會不知道自己為什麼這樣做！
※ 編輯: dawnga (49.217.0.206 臺灣), 09/12/2021 10:32:50