作者dawnga (Dawn)
看板Biotech
标题[求救] 免疫沉淀（IP)问题
时间Sat Aug 21 12:41:28 2021
前辈好
最近要做IP後跑western ，实验室以往没有做过没有人可以询问，所以研究有些吃力，研
究许多protocol 後，有问题几个问题想请教前辈。
先简要叙述步骤：
蛋白定量後的样品与（1.适量一抗）混合overnight,隔天加入活化後beads 约两小时抓下
抗原抗体，（2.清洗）後离心留下沈淀物，加入（3.sample dye) 30uL，加热95度/5分钟
，完成。
请问前辈
1. 适量一抗一般标准是多少，第一次做该如何决定？
2. wash 沈淀物步骤，实验室beads的datasheet 中写「water」，我觉得有些奇怪，也有
看过中文论文以RIPA buffer 及 wash buffer ，不知何者较常见？
3.沈淀物加入30uL sample dye，所有的中英protocol 都这样写。我有一些疑问,以下有
四：
a. 所以sample 最後只有30uL 吗？！ 这样不是很浓吗！跟先前定量的感觉也没有关联呀
？
b. 之後跑western 胶要load多少量呢？
c. Beads 是不是也在dye里 ，也会被load进去吗......
d. sample dye(6X) 应该要先稀释成1X再加入30uL 吗？
先谢谢前辈指教了！
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 49.217.136.33 (台湾)
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1F：推 soend: 实验室之前有做过western吗？08/21 19:53
2F：推 soend: 如果没有，建议你先研究western 的原理，IP只是样本前处理 08/21 19:55
3F：→ soend: 不同而已
有做过，我会再多了解！
08/21 19:55
4F：推 CSFV: 珠珠load进去没关系，会卡在well里面，不会跑进胶里面08/21 21:52
5F：→ CSFV: 之前做完IP要拿去打质谱前是这样弄的
好的！了解 谢谢
08/21 21:52
6F：→ blence: IP抗体用量看datasheet,或参考abcam "Unpurified antibody08/22 14:43
7F：→ blence: concentrations"有相关的用量介绍08/22 14:43
8F：→ blence: 原则上wash会是PBS不是水,通常是当初用的lysis buffer或去08/22 14:43
9F：→ blence: 除detergent成分的buffer等,像是CSK buffer08/22 14:44
10F：→ blence: RIPA不适合在coIP或一般IP当wash buffer使用08/22 14:45
11F：→ blence: 多数IP能抓的是原本lysate的10~20%的蛋白,太多sample dye08/22 14:56
12F：→ blence: 没必要,以30ul来说,刚好可以跑1次胶跟保留1次repeat机会08/22 14:58
谢谢您的详细解说，跟您确认一下我的理解是否正确！ 所以我原先认为只有30uL会有很
浓度蛋白是不对的想法，因为IP後的蛋白可能剩不到两成，所以跑胶时load量仍跟平常差
不多（10uL/well)吗
※ 编辑: dawnga (49.217.3.144 台湾), 08/22/2021 16:16:45
13F：推 soend: 建议跑IP之前，先测试该细胞里你想要抓的蛋白的表现量，这 08/22 22:54
14F：→ soend: 样才有办法决定你要下多少蛋白量去抓。一抗要买有标可以IP 08/22 22:54
15F：→ soend: 的抗体，浓度可以先参照上面写的。至於要loading 多少量，08/22 22:54
16F：→ soend: 也是参照表现量而定。就像前面说的，可以抓下来的量可能很08/22 22:54
17F：→ soend: 少，你如果还loading很少，可能也无法被侦测到。假设protoc08/22 22:54
18F：→ soend: ol 是建议用30ul去煮，通常就是全部loading 进去（使用大08/22 22:54
19F：→ soend: 的well),你说的10ul/well,应该是小的well 08/22 22:54
谢谢！！我这几天很忙碌没有时间回覆，感谢你的帮助，我有成功哦
20F：推 tynse71864: 1. 一般第一次我会用 1ug 抗体去抓 没浓度的话用 1ul08/25 11:35
21F：→ tynse71864: 2. 我一般用 2x sample elution , 效果会比一倍的好 (08/25 11:35
22F：→ tynse71864: 我同学也有人用 5X的，只是很难 pipet)08/25 11:35
谢谢！我跟您一样使用两倍所以成功了，但是请教一下，一倍效果不好会看到什麽状况吗
？
23F：→ blence: bead体积残余的wash buffer不管再怎麽处理都不能完全去除 08/25 14:34
24F：→ blence: 所以放1x elution一定会稀释,效果想必不好 08/25 14:35
了解了 谢谢您～
25F：→ xxtomnyxx: 抗体用量建议做个titration，bead其实有一种filter08/25 19:21
26F：→ xxtomnyxx: column可以把elution buffer 和 bead 分开，通常加了多 08/25 19:22
27F：→ xxtomnyxx: 少bead我就当作他体积有多少(就算是slurry也一样)，然 08/25 19:23
28F：→ xxtomnyxx: 後用那个体积去回推要加几倍的sample buffer。 08/25 19:23
29F：→ xxtomnyxx: Wash buffer要用什麽其实很不一定，看你实验的目的决定 08/25 19:24
30F：→ xxtomnyxx: ，如果你只是要抓target protein，wash可以用比lysis08/25 19:25
31F：→ xxtomnyxx: buffer更强的(如NaCl浓度提高)去洗，但是如果你是要抓 08/25 19:25
32F：→ xxtomnyxx: 其他和target protein在一起的蛋白质(也就是其实是做 08/25 19:26
33F：→ xxtomnyxx: co-IP)，通常就是直接用lysis buffer去洗，而且lysis08/25 19:26
34F：→ xxtomnyxx: buffer不会用到RIPA，通常是用triton或NP40这类不会破08/25 19:27
35F：→ xxtomnyxx: 坏蛋白质构型的两性分子配制lysis buffer。 08/25 19:28
谢谢您的详细说明～这几天有点忙没有时间回覆，非常感谢你的帮助，我有成功哦，而且
得到了很多小知识，这个实验室只有我一个人，所以在学习上有些辛苦（汗
36F：→ ad1980: 同前面推文说的，通常是用之前的 lysis buffer 洗，然後 3 08/31 23:30
37F：→ ad1980: 0 ul beads 我是用 30 ul 2X sample buffer，煮了以後 spi08/31 23:30
38F：→ ad1980: n down beads，如果不想 load beads 到 wells 里，可以用08/31 23:30
39F：→ ad1980: 细长的那种 gel loading tips。08/31 23:30
谢谢你的说明，很详细让我完全了解，不会不知道自己为什麽这样做！
※ 编辑: dawnga (49.217.0.206 台湾), 09/12/2021 10:32:50