作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
標題[求救] .22 PVDF 與 >100kda protein
時間Sun Jul 25 14:05:32 2021
想請問關於PVDF pore size和protein size
有點好笑(?)的問題
實驗室最近想壓一個約15kda的protein
原本用.45 PVDF壓出來的效果覺得不是很好
有聽過說壓小分子protein可以選擇用.22 um的會比較好
但是因為同時會需要看約130kda的protein
想請問會有可能因為換了.22 PVDF後導致大protein卡不進洞裡(?)而tran不過去
或是因為其他的原因使得大protein變得難壓嗎?
還是說.22的吸附能力就是比.45強
經濟許可下.22一定會是最首選呢?
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.50.146 (臺灣)
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※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/25/2021 14:08:12
1F：推 r03b43022: 大的蛋白質應不至於transfer 不過去 07/25 16:48
謝謝您的回覆，我後來想想自己問的問題好像有點白痴
如果真這樣過不去，大家平常.22過無菌應該一堆東西就都不見了XD
但還是想問問大家實際上的經驗
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/25/2021 16:56:42
2F：→ xxtomnyxx: 如果你知道PVDF是怎麼黏蛋白質的，就不會覺得會「卡不 07/26 09:07
3F：→ xxtomnyxx: 進洞裡」了。 07/26 09:07
4F：→ xxtomnyxx: 我家一直用 .45 的PVDF，一張上面同時要看1x kDa 和～ 07/26 09:14
5F：→ xxtomnyxx: 200 kDa 是家常便飯，如果你懷疑因為蛋白質太小穿過PV 07/26 09:14
6F：→ xxtomnyxx: DF，可以先試試看transfer時放兩片PVDF，然後比較看看 07/26 09:14
7F：→ xxtomnyxx: 兩片PVDF上的染色結果。 07/26 09:14
我後來也覺得我問這個問題真的是有點愚蠢(汗
兩片PVDF我覺得是一個很好的嘗試
謝謝您的建議，我會試試看！
8F：推 tynse71864: 不會； 倒是可能轉漬時間或 bfr等原因 導致130的轉漬 07/26 13:38
9F：→ tynse71864: 效果不好 07/26 13:38
看起來得多試試幾個條件
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/26/2021 15:04:17
10F：→ xxtomnyxx: 我自己有測試過，transfer buffer的配方影響非常大， 07/26 22:20
11F：→ xxtomnyxx: 有沒有加SDS、SDS的濃度、用的是 Towbin、2x Towbin 還 07/26 22:24
12F：→ xxtomnyxx: 是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer？反而methanol濃度 07/26 22:24
13F：→ xxtomnyxx: 10% 和 20% 沒什麼影響，那次測完才知道我原本用的系統 07/26 22:25
14F：→ xxtomnyxx: over transfer 非常嚴重，可能有10%~25%的蛋白質都穿過 07/26 22:25
15F：→ xxtomnyxx: 去了..... 07/26 22:26
沒想過調condition真不知道裡頭大哉問
好好來研究研究.....
16F：推 tynse71864: 其實15kda用.45可以啦 不要轉太久就好 我以前常做 07/27 13:23
好的，感謝建議！
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/27/2021 13:51:25
17F：推 Ianthegood: 順便借問一下 一樣差不多130的膜蛋白有什麼好用的tran 07/27 19:49
18F：→ Ianthegood: sfer buffer condition嗎？ 07/27 19:49
我們原本是用5.8g Tris+2.9g glycine+5ml 10% SDS+800ml 水 然後調pH到9.2再補200ml methanol
400mA transfer 1小時 溼式的 僅供參考XD
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 07/28/2021 08:17:18
19F：→ blence: 為什麼要調pH？ 07/28 19:46
20F：→ blence: 如果％偏高的話,400mA/1h應該會有些high MW還在膠上 07/28 19:48
21F：推 osla30: 調pH不會降低緩衝能力嗎？ 07/28 19:50
22F：→ xxtomnyxx: 你的 transfer 是半乾還是濕式？如果是濕式，你的 TB 07/28 21:41
23F：→ xxtomnyxx: 配方看起來是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer + 0.05% 07/28 21:42
24F：→ xxtomnyxx: SDS，我直接告訴你，這個就是我說的「原本用的會有大量 07/28 21:43
25F：→ xxtomnyxx: 蛋白直穿過去的系統」 07/28 21:43
26F：推 darrenyo: 小protein transfer 建議不要加SDS 容易過頭 07/29 07:22
27F：→ raiyu: 不是有marker嗎? 07/31 20:16
28F：→ raiyu: 我們家289kDa跟8kDa的都用一樣的buffer跟膜 07/31 20:20