作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
标题[求救] .22 PVDF 与 >100kda protein
时间Sun Jul 25 14:05:32 2021
想请问关於PVDF pore size和protein size
有点好笑(?)的问题
实验室最近想压一个约15kda的protein
原本用.45 PVDF压出来的效果觉得不是很好
有听过说压小分子protein可以选择用.22 um的会比较好
但是因为同时会需要看约130kda的protein
想请问会有可能因为换了.22 PVDF後导致大protein卡不进洞里(?)而tran不过去
或是因为其他的原因使得大protein变得难压吗?
还是说.22的吸附能力就是比.45强
经济许可下.22一定会是最首选呢?
谢谢
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※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 07/25/2021 14:08:12
1F：推 r03b43022: 大的蛋白质应不至於transfer 不过去 07/25 16:48
谢谢您的回覆，我後来想想自己问的问题好像有点白痴
如果真这样过不去，大家平常.22过无菌应该一堆东西就都不见了XD
但还是想问问大家实际上的经验
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 07/25/2021 16:56:42
2F：→ xxtomnyxx: 如果你知道PVDF是怎麽黏蛋白质的，就不会觉得会「卡不 07/26 09:07
3F：→ xxtomnyxx: 进洞里」了。 07/26 09:07
4F：→ xxtomnyxx: 我家一直用 .45 的PVDF，一张上面同时要看1x kDa 和～ 07/26 09:14
5F：→ xxtomnyxx: 200 kDa 是家常便饭，如果你怀疑因为蛋白质太小穿过PV 07/26 09:14
6F：→ xxtomnyxx: DF，可以先试试看transfer时放两片PVDF，然後比较看看 07/26 09:14
7F：→ xxtomnyxx: 两片PVDF上的染色结果。 07/26 09:14
我後来也觉得我问这个问题真的是有点愚蠢(汗
两片PVDF我觉得是一个很好的尝试
谢谢您的建议，我会试试看！
8F：推 tynse71864: 不会； 倒是可能转渍时间或 bfr等原因 导致130的转渍 07/26 13:38
9F：→ tynse71864: 效果不好 07/26 13:38
看起来得多试试几个条件
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 07/26/2021 15:04:17
10F：→ xxtomnyxx: 我自己有测试过，transfer buffer的配方影响非常大， 07/26 22:20
11F：→ xxtomnyxx: 有没有加SDS、SDS的浓度、用的是 Towbin、2x Towbin 还 07/26 22:24
12F：→ xxtomnyxx: 是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer？反而methanol浓度 07/26 22:24
13F：→ xxtomnyxx: 10% 和 20% 没什麽影响，那次测完才知道我原本用的系统 07/26 22:25
14F：→ xxtomnyxx: over transfer 非常严重，可能有10%~25%的蛋白质都穿过 07/26 22:25
15F：→ xxtomnyxx: 去了..... 07/26 22:26
没想过调condition真不知道里头大哉问
好好来研究研究.....
16F：推 tynse71864: 其实15kda用.45可以啦 不要转太久就好 我以前常做 07/27 13:23
好的，感谢建议！
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 07/27/2021 13:51:25
17F：推 Ianthegood: 顺便借问一下 一样差不多130的膜蛋白有什麽好用的tran 07/27 19:49
18F：→ Ianthegood: sfer buffer condition吗？ 07/27 19:49
我们原本是用5.8g Tris+2.9g glycine+5ml 10% SDS+800ml 水 然後调pH到9.2再补200ml methanol
400mA transfer 1小时 湿式的 仅供参考XD
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 07/28/2021 08:17:18
19F：→ blence: 为什麽要调pH？ 07/28 19:46
20F：→ blence: 如果％偏高的话,400mA/1h应该会有些high MW还在胶上 07/28 19:48
21F：推 osla30: 调pH不会降低缓冲能力吗？ 07/28 19:50
22F：→ xxtomnyxx: 你的 transfer 是半乾还是湿式？如果是湿式，你的 TB 07/28 21:41
23F：→ xxtomnyxx: 配方看起来是 Bjerrum Schafer-Nielsen Buffer + 0.05% 07/28 21:42
24F：→ xxtomnyxx: SDS，我直接告诉你，这个就是我说的「原本用的会有大量 07/28 21:43
25F：→ xxtomnyxx: 蛋白直穿过去的系统」 07/28 21:43
26F：推 darrenyo: 小protein transfer 建议不要加SDS 容易过头 07/29 07:22
27F：→ raiyu: 不是有marker吗? 07/31 20:16
28F：→ raiyu: 我们家289kDa跟8kDa的都用一样的buffer跟膜 07/31 20:20