作者Gmarket (.)
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標題[求救] Western band 糊掉、斷裂+背景髒
時間Sat May 15 17:42:33 2021
前輩們好!!
想請教關於western blot的問題，
先提供我的實驗條件:
1. sample protein 100 ug , loading 15 uL
2.running 60V/25min + 110V/120 min (埋冰上)
3.transfer 10V/110min (半乾式)
2+3的條件都是沿用學長的
PVDF膜浸泡甲醇從5分鐘改到10分鐘甚至超過都有
Blocking 3% BSA 2 hr/RT, 一抗 4℃/overnight (也有shaker)
→Wash 4*10min (原本3次改4次)
→二抗 1hr/RT
→Wash 4*10min
ECL也是1:1配法
製膠配方: 10%膠
下膠:
30% acrylamide 4 mL + H2O 4.8 mL+ 1.5M Tris HCl 3 mL+ 10% SDS 120 uL+ TEMED 16 uL+ 10% APS 100 uL
上膠:
30% acrylamide 0.83 mL + H2O 3.67 mL+ 0.5M Tris HCl 0.42mL+ 10% SDS 50 uL+ TEMED 10 uL+ 10% APS 25 uL
Ponceau S 跟coomassie blue 都染過很正常看不出特別問題
問題為:
1. β-actin或是其他band 總是會有糊掉的情形，原本沒有但是突然出現，之後就再也回不去了，β-actin最嚴重!!
β-actin一抗濃度為1:5000、二抗為1:7500
其他測的有COX-2 (一抗, TRPV1, TRPA1
2.background有時會有直線痕跡以及偶爾出現很髒的背景
這個直線痕跡時好時壞，有時候還會有很像水痕狀的感覺
調整:
有試過當日現配running buffer但沒有顯著影響
也有試過當天製膠當天跑(原本都是前一天下午製膠) 但也沒有影響
因為實在調整過很多條件但都沒有改善QQ 希望前輩們能給予意見 謝謝!!!
以下附圖:
Ponceau S
https://m.imgur.com/a/7AdMBuW
coomassie blue
https://imgur.com/a/vTzvyhm
糊掉的band:
https://imgur.com/a/v1O2bSj
https://imgur.com/a/DzrncRy
背景髒、直線痕跡:
https://imgur.com/a/b2nxg36
https://imgur.com/a/Juehq1V
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1F：推 monkey60391: 會不會是sample的問題，沒有破乾淨或有一些殘渣之類 05/15 18:34
2F：→ monkey60391: 看你marker跑得很漂亮應該不會是western步驟的關係 05/15 18:34
Sample均質過後離心有放-80隔夜然後又重新高速離心，所以我覺得離的算蠻乾淨的
(20000 rcf/ 10min)，不好意思，忘記說我的sample是大鼠腸組織QQ
3F：推 a225588779: blocking 是用奶粉泡的嗎 有沒有確認都溶解了再加下去 05/15 18:43
4F：→ a225588779: blocking? 05/15 18:43
Blocking 是用3% BSA，也有用小飛碟過濾
5F：→ robbercat: Transfer buffer 最好每次新配 05/15 22:26
因為半乾式所使用的transfer 量不多所以每次重新配好像有點難度QQ
6F：→ robbercat: Sample可能有太多DNA 建議先做完sonication再loading 05/15 22:40
7F：→ robbercat: 而且sample的量100ug/well太多了 最多不超過40ug/well 05/15 22:40
9F：→ robbercat: ce/protein-biology/protein-biology-learning-center 05/15 22:51
10F：→ robbercat: /protein-gel-electrophoresis-information/western-b 05/15 22:51
11F：→ robbercat: lot-troubleshooting.html#pge1提供你參考 05/15 22:51
不好意思，請問sonication是?? Sample protein原本有試過50 ug 跟100 ug 比較，但因
為100 ug壓出來的band會比較清楚明顯所以才選用100ug，
https://imgur.com/QxYnofi
13F：→ Ice9: 100ug 太多 05/16 00:18
14F：→ iiidns: wash buffer的ph值有沒有調? 05/16 14:33
Wash buffer 都是用配好的10被稀釋，所以沒有特別去調PH
15F：推 a0976134: 我寧願改變抗體濃度， 05/16 21:06
16F：→ a0976134: 也不要sample多到影響背景。 05/16 21:06
17F：→ a0976134: 蛋白要是很好抓，少量就夠了。 05/16 21:06
18F：→ a0976134: 大不了曝光時間拉長。 05/16 21:06
好的，會再進行調整看看，謝謝!!
19F：推 tynse71864: 100有點太多， 跑的時候很容易漏+變形。這種小膠40ug 05/16 21:45
20F：→ tynse71864: 就很多了； 建議同上可以拉高一抗的強度然後曝光久一 05/16 21:45
21F：→ tynse71864: 點 05/16 21:45
好的，會再減半蛋白量試試，謝謝!!
22F：推 uouim: WB圖看起來像transfer 時膜跟膠之間沒貼好，有buffer殘留在 05/16 21:47
23F：→ uouim: 中間。 05/16 21:47
有可能是膠放上去沒有壓好@@，覺得半乾式就是會有一種不確定到底東西有沒有壓好的窘
境@@
24F：推 tynse71864: b-actin 看起來有點像過曝後稍微反白的情況? 我壓過鼠 05/16 21:52
25F：→ tynse71864: 小腸 那時候下50ug 我 actin一抗是下1:10k 起跳的.. 05/16 21:52
26F：→ tynse71864: . 有時候一或二抗 濃度太多都會有疑似的擦去痕跡 05/16 21:52
27F：推 tynse71864: blocking有試過奶粉嗎? 最下面那張 比較美的膠圖還是 05/16 21:56
28F：→ tynse71864: 許多非專一結合，搞不好用牛奶後就不用這麼多 lysate 05/16 21:56
29F：→ tynse71864: 了? 05/16 21:56
30F：→ tynse71864: 我通常是濕式轉，有朋友半乾轉的可能因為蓋子壓不緊而 05/16 21:58
31F：→ tynse71864: 轉不好 05/16 21:58
我的actin 一抗1:5000去壓，是沿用學長姐之前配好的比例，二抗是1:7500 也是沿用學
長姊QQ ，blocking有試過奶粉但效果沒有太大差異T_T，有注意到蓋子有可能沒壓緊，所
以現在下手會重一點!! 謝謝!!
32F：→ robbercat: Domination 將sample利用超音波震盪把DNA震碎避免黏稠 05/17 21:16
33F：→ robbercat: Sonication 05/17 21:16
了解!! 因為我們家實驗室好像沒有這個習慣，通常均質完離心就開始配，之後會嘗試看
看謝謝!!
34F：推 ad1980: 我之前是用 syringe 過 sample 幾次讓它不黏稠，沒有 soni 05/17 22:59
35F：→ ad1980: cator 的話可以試試。 05/17 22:59
好的，謝謝!! 會再試試
36F：→ xxtomnyxx: 我試過用26G針過好幾次，雖然會變的不黏稠，但是跑WB還 05/18 06:44
37F：→ xxtomnyxx: 適有嚴重拖條現像，DNA的問題要根治我覺得只有把DNA沉 05/18 06:45
38F：→ xxtomnyxx: 澱離心掉，或者用DNase I或Benzonase把DNA切掉這兩種 05/18 06:46
39F：→ xxtomnyxx: 方法最有效 05/18 06:46
好的，因為實驗室好像沒有這方面處理經驗，我會再詢問看看，謝謝!!
40F：推 joann88431: 換另一個牌子的抗體看看！ 05/19 00:04
ㄜ….經費考量QQ
41F：推 tynse71864: 想問你 pipet樣品時有勾勾 (台語) 的嗎？ 如果沒有DNA 05/19 02:37
42F：→ tynse71864: 問題可能不用太擔心 05/19 02:37
不會耶! 挺順的(?
43F：推 MLSHBen: 以前半乾式transfer是教定電流 90mA/片 的樣子？ 05/20 00:43
學長姐教訂電壓10V =口=
44F：推 michealking: 你的sample buffer? 買個現成的蛋白來做梯度練習， 05/22 01:09
45F：→ michealking: 我覺得你的膠到壓好半乾可能都不太穩定。最好找abcam 05/22 01:09
46F：→ michealking: 的protocol 全部照著重做一次，到你的梯度穩定為止。 05/22 01:09
TAT 這可能有困難，一方面經費考量一方面今年要趕畢業QQ
47F：推 MartianIT: 你的sample是什麼? 05/24 08:56
48F：→ MartianIT: rat intestine! 會不會是mucus或什麼sugar多的東東? 05/24 08:58
49F：→ MartianIT: 收檢體時 有沒有用刀背把mucus刮一刮或用PBS或NS沖一沖 05/24 09:01
沒有!!!! 但有用PBS沖洗
※ 編輯: Gmarket (210.71.153.125 臺灣), 05/26/2021 14:03:39
50F：推 walker456: 單純下的sample量太大而已 08/26 01:16