作者Gmarket (.)
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标题[求救] Western band 糊掉、断裂+背景脏
时间Sat May 15 17:42:33 2021
前辈们好!!
想请教关於western blot的问题，
先提供我的实验条件:
1. sample protein 100 ug , loading 15 uL
2.running 60V/25min + 110V/120 min (埋冰上)
3.transfer 10V/110min (半乾式)
2+3的条件都是沿用学长的
PVDF膜浸泡甲醇从5分钟改到10分钟甚至超过都有
Blocking 3% BSA 2 hr/RT, 一抗 4℃/overnight (也有shaker)
→Wash 4*10min (原本3次改4次)
→二抗 1hr/RT
→Wash 4*10min
ECL也是1:1配法
制胶配方: 10%胶
下胶:
30% acrylamide 4 mL + H2O 4.8 mL+ 1.5M Tris HCl 3 mL+ 10% SDS 120 uL+ TEMED 16 uL+ 10% APS 100 uL
上胶:
30% acrylamide 0.83 mL + H2O 3.67 mL+ 0.5M Tris HCl 0.42mL+ 10% SDS 50 uL+ TEMED 10 uL+ 10% APS 25 uL
Ponceau S 跟coomassie blue 都染过很正常看不出特别问题
问题为:
1. β-actin或是其他band 总是会有糊掉的情形，原本没有但是突然出现，之後就再也回不去了，β-actin最严重!!
β-actin一抗浓度为1:5000、二抗为1:7500
其他测的有COX-2 (一抗, TRPV1, TRPA1
2.background有时会有直线痕迹以及偶尔出现很脏的背景
这个直线痕迹时好时坏，有时候还会有很像水痕状的感觉
调整:
有试过当日现配running buffer但没有显着影响
也有试过当天制胶当天跑(原本都是前一天下午制胶) 但也没有影响
因为实在调整过很多条件但都没有改善QQ 希望前辈们能给予意见 谢谢!!!
以下附图:
Ponceau S
https://m.imgur.com/a/7AdMBuW
coomassie blue
https://imgur.com/a/vTzvyhm
糊掉的band:
https://imgur.com/a/v1O2bSj
https://imgur.com/a/DzrncRy
背景脏、直线痕迹:
https://imgur.com/a/b2nxg36
https://imgur.com/a/Juehq1V
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1F：推 monkey60391: 会不会是sample的问题，没有破乾净或有一些残渣之类 05/15 18:34
2F：→ monkey60391: 看你marker跑得很漂亮应该不会是western步骤的关系 05/15 18:34
Sample均质过後离心有放-80隔夜然後又重新高速离心，所以我觉得离的算蛮乾净的
(20000 rcf/ 10min)，不好意思，忘记说我的sample是大鼠肠组织QQ
3F：推 a225588779: blocking 是用奶粉泡的吗 有没有确认都溶解了再加下去 05/15 18:43
4F：→ a225588779: blocking? 05/15 18:43
Blocking 是用3% BSA，也有用小飞碟过滤
5F：→ robbercat: Transfer buffer 最好每次新配 05/15 22:26
因为半乾式所使用的transfer 量不多所以每次重新配好像有点难度QQ
6F：→ robbercat: Sample可能有太多DNA 建议先做完sonication再loading 05/15 22:40
7F：→ robbercat: 而且sample的量100ug/well太多了 最多不超过40ug/well 05/15 22:40
9F：→ robbercat: ce/protein-biology/protein-biology-learning-center 05/15 22:51
10F：→ robbercat: /protein-gel-electrophoresis-information/western-b 05/15 22:51
11F：→ robbercat: lot-troubleshooting.html#pge1提供你参考 05/15 22:51
不好意思，请问sonication是?? Sample protein原本有试过50 ug 跟100 ug 比较，但因
为100 ug压出来的band会比较清楚明显所以才选用100ug，
https://imgur.com/QxYnofi
13F：→ Ice9: 100ug 太多 05/16 00:18
14F：→ iiidns: wash buffer的ph值有没有调? 05/16 14:33
Wash buffer 都是用配好的10被稀释，所以没有特别去调PH
15F：推 a0976134: 我宁愿改变抗体浓度， 05/16 21:06
16F：→ a0976134: 也不要sample多到影响背景。 05/16 21:06
17F：→ a0976134: 蛋白要是很好抓，少量就够了。 05/16 21:06
18F：→ a0976134: 大不了曝光时间拉长。 05/16 21:06
好的，会再进行调整看看，谢谢!!
19F：推 tynse71864: 100有点太多， 跑的时候很容易漏+变形。这种小胶40ug 05/16 21:45
20F：→ tynse71864: 就很多了； 建议同上可以拉高一抗的强度然後曝光久一 05/16 21:45
21F：→ tynse71864: 点 05/16 21:45
好的，会再减半蛋白量试试，谢谢!!
22F：推 uouim: WB图看起来像transfer 时膜跟胶之间没贴好，有buffer残留在 05/16 21:47
23F：→ uouim: 中间。 05/16 21:47
有可能是胶放上去没有压好@@，觉得半乾式就是会有一种不确定到底东西有没有压好的窘
境@@
24F：推 tynse71864: b-actin 看起来有点像过曝後稍微反白的情况? 我压过鼠 05/16 21:52
25F：→ tynse71864: 小肠 那时候下50ug 我 actin一抗是下1:10k 起跳的.. 05/16 21:52
26F：→ tynse71864: . 有时候一或二抗 浓度太多都会有疑似的擦去痕迹 05/16 21:52
27F：推 tynse71864: blocking有试过奶粉吗? 最下面那张 比较美的胶图还是 05/16 21:56
28F：→ tynse71864: 许多非专一结合，搞不好用牛奶後就不用这麽多 lysate 05/16 21:56
29F：→ tynse71864: 了? 05/16 21:56
30F：→ tynse71864: 我通常是湿式转，有朋友半乾转的可能因为盖子压不紧而 05/16 21:58
31F：→ tynse71864: 转不好 05/16 21:58
我的actin 一抗1:5000去压，是沿用学长姐之前配好的比例，二抗是1:7500 也是沿用学
长姊QQ ，blocking有试过奶粉但效果没有太大差异T_T，有注意到盖子有可能没压紧，所
以现在下手会重一点!! 谢谢!!
32F：→ robbercat: Domination 将sample利用超音波震荡把DNA震碎避免黏稠 05/17 21:16
33F：→ robbercat: Sonication 05/17 21:16
了解!! 因为我们家实验室好像没有这个习惯，通常均质完离心就开始配，之後会尝试看
看谢谢!!
34F：推 ad1980: 我之前是用 syringe 过 sample 几次让它不黏稠，没有 soni 05/17 22:59
35F：→ ad1980: cator 的话可以试试。 05/17 22:59
好的，谢谢!! 会再试试
36F：→ xxtomnyxx: 我试过用26G针过好几次，虽然会变的不黏稠，但是跑WB还 05/18 06:44
37F：→ xxtomnyxx: 适有严重拖条现像，DNA的问题要根治我觉得只有把DNA沉 05/18 06:45
38F：→ xxtomnyxx: 淀离心掉，或者用DNase I或Benzonase把DNA切掉这两种 05/18 06:46
39F：→ xxtomnyxx: 方法最有效 05/18 06:46
好的，因为实验室好像没有这方面处理经验，我会再询问看看，谢谢!!
40F：推 joann88431: 换另一个牌子的抗体看看！ 05/19 00:04
ㄜ….经费考量QQ
41F：推 tynse71864: 想问你 pipet样品时有勾勾 (台语) 的吗？ 如果没有DNA 05/19 02:37
42F：→ tynse71864: 问题可能不用太担心 05/19 02:37
不会耶! 挺顺的(?
43F：推 MLSHBen: 以前半乾式transfer是教定电流 90mA/片 的样子？ 05/20 00:43
学长姐教订电压10V =口=
44F：推 michealking: 你的sample buffer? 买个现成的蛋白来做梯度练习， 05/22 01:09
45F：→ michealking: 我觉得你的胶到压好半乾可能都不太稳定。最好找abcam 05/22 01:09
46F：→ michealking: 的protocol 全部照着重做一次，到你的梯度稳定为止。 05/22 01:09
TAT 这可能有困难，一方面经费考量一方面今年要赶毕业QQ
47F：推 MartianIT: 你的sample是什麽? 05/24 08:56
48F：→ MartianIT: rat intestine! 会不会是mucus或什麽sugar多的东东? 05/24 08:58
49F：→ MartianIT: 收检体时 有没有用刀背把mucus刮一刮或用PBS或NS冲一冲 05/24 09:01
没有!!!! 但有用PBS冲洗
※ 编辑: Gmarket (210.71.153.125 台湾), 05/26/2021 14:03:39
50F：推 walker456: 单纯下的sample量太大而已 08/26 01:16