作者Abcbc123 (哇哈哈)
看板Biotech
標題WB蛋白跑不下去
時間Tue Apr 27 14:35:44 2021
求救
https://imgur.com/a/i033WuH
最近跑的WB都呈現這樣子，
壓得抗體已經是GAPDH，
但顯色的地方也不是目標分子量，
跑了好幾片都長這樣
（顯色有高有低，但都很醜，位置也不對）
sample是細胞蛋白
上膠 80V 160mA
下膠 120V 160mA
Running buffer:Tris Base 30g+glycine 144g+SDS 10ml 定容到1L
Transfer是半乾式，30V 400mA 1小時15分
看起來像蛋白沒有跑下去（？
但marker和dye都有跑到底了
會是sample沒有變性嗎？
-----
Sent from JPTT on my iPhone
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.137.119.140 (臺灣)
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1619505346.A.B71.html
1F：→ Ianthegood: transfer沒壓緊 04/27 17:44
2F：推 Ianthegood: 上下膠pH有對嗎？ 04/27 17:46
3F：→ blence: running buffer顯然不對 04/27 20:02
4F：推 moon0126: 應該是running buffer的問題 04/27 22:13
5F：推 darrenyo: Running buffer配方看起來是10X的... 04/28 00:45
6F：推 florasflanaa: 你算一下你的tris是0.25M，glycine1.92M，SDS用100% 04/28 01:24
7F：→ florasflanaa: 配完是1%，這是10Xbuffer的濃度，pH要調到8.3，tris 04/28 01:24
8F：→ florasflanaa: base非常鹼 04/28 01:24
9F：→ xxtomnyxx: SDS沒有100%啦，水溶液最多也20%，假設是10%那SDS濃度 04/28 02:10
10F：→ xxtomnyxx: 是對的。Tris-Glycine-SDS的配方是25 mM Tris base, 1 04/28 02:10
11F：→ xxtomnyxx: 92 mM Glycine, 0.1% SDS。Tris base 也有用 24.76 mM 04/28 02:10
12F：→ xxtomnyxx: 的就是 1 L加30克比較好秤。然後我個人強烈建議「不要 04/28 02:10
13F：→ xxtomnyxx: 調pH！」就算要調也絕對不要用 HCl 或 NaOH 調，請用G 04/28 02:10
14F：→ xxtomnyxx: lycine或Tris base 調pH。 04/28 02:10
15F：→ blence: SDS也是鹼,沒事別調pH,直接用就好 04/28 06:59
16F：→ blence: 產生的鹽跑膠時讓buffer過熱,只能用低電壓慢慢跑 04/28 07:00
17F：→ Abcbc123: 對對 running buffer是10倍的 用之前稀釋成1倍 沒有調pH 04/28 11:10
18F：→ Abcbc123: 值 04/28 11:10
19F：→ xxtomnyxx: 如果你上面寫的那個 1 L 是10倍的配法，假設你的SDS 10 04/28 22:14
20F：→ xxtomnyxx: mL 是指 10% SDS 加 10 mL，那你的 1 倍溶液中的 SDS就 04/28 22:15
21F：→ xxtomnyxx: 只有標準的 1/10.... 04/28 22:15
22F：推 yaes111: dye有跟sample混在一起再加熱變性過吧？ 04/29 17:39
23F：推 Devilxxx: sample沒處理好？ 05/02 18:50