作者Abcbc123 (哇哈哈)
看板Biotech
标题WB蛋白跑不下去
时间Tue Apr 27 14:35:44 2021
求救
https://imgur.com/a/i033WuH
最近跑的WB都呈现这样子，
压得抗体已经是GAPDH，
但显色的地方也不是目标分子量，
跑了好几片都长这样
（显色有高有低，但都很丑，位置也不对）
sample是细胞蛋白
上胶 80V 160mA
下胶 120V 160mA
Running buffer:Tris Base 30g+glycine 144g+SDS 10ml 定容到1L
Transfer是半乾式，30V 400mA 1小时15分
看起来像蛋白没有跑下去（？
但marker和dye都有跑到底了
会是sample没有变性吗？
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1F：→ Ianthegood: transfer没压紧 04/27 17:44
2F：推 Ianthegood: 上下胶pH有对吗？ 04/27 17:46
3F：→ blence: running buffer显然不对 04/27 20:02
4F：推 moon0126: 应该是running buffer的问题 04/27 22:13
5F：推 darrenyo: Running buffer配方看起来是10X的... 04/28 00:45
6F：推 florasflanaa: 你算一下你的tris是0.25M，glycine1.92M，SDS用100% 04/28 01:24
7F：→ florasflanaa: 配完是1%，这是10Xbuffer的浓度，pH要调到8.3，tris 04/28 01:24
8F：→ florasflanaa: base非常硷 04/28 01:24
9F：→ xxtomnyxx: SDS没有100%啦，水溶液最多也20%，假设是10%那SDS浓度 04/28 02:10
10F：→ xxtomnyxx: 是对的。Tris-Glycine-SDS的配方是25 mM Tris base, 1 04/28 02:10
11F：→ xxtomnyxx: 92 mM Glycine, 0.1% SDS。Tris base 也有用 24.76 mM 04/28 02:10
12F：→ xxtomnyxx: 的就是 1 L加30克比较好秤。然後我个人强烈建议「不要 04/28 02:10
13F：→ xxtomnyxx: 调pH！」就算要调也绝对不要用 HCl 或 NaOH 调，请用G 04/28 02:10
14F：→ xxtomnyxx: lycine或Tris base 调pH。 04/28 02:10
15F：→ blence: SDS也是硷,没事别调pH,直接用就好 04/28 06:59
16F：→ blence: 产生的盐跑胶时让buffer过热,只能用低电压慢慢跑 04/28 07:00
17F：→ Abcbc123: 对对 running buffer是10倍的 用之前稀释成1倍 没有调pH 04/28 11:10
18F：→ Abcbc123: 值 04/28 11:10
19F：→ xxtomnyxx: 如果你上面写的那个 1 L 是10倍的配法，假设你的SDS 10 04/28 22:14
20F：→ xxtomnyxx: mL 是指 10% SDS 加 10 mL，那你的 1 倍溶液中的 SDS就 04/28 22:15
21F：→ xxtomnyxx: 只有标准的 1/10.... 04/28 22:15
22F：推 yaes111: dye有跟sample混在一起再加热变性过吧？ 04/29 17:39
23F：推 Devilxxx: sample没处理好？ 05/02 18:50