作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
標題[求救] MRC-5 trypsinize後存活不佳
時間Mon Nov 9 22:02:03 2020
大家好 不好意思又來打擾
最近開始養MRC-5這株Lung fibroblast
Medium的成分都是完全參照ATCC
養起來型態都挺正常的
(就是癌細胞養慣了覺得長的好慢)
只是在Trypsinized後染Trypan blue
都會有很多死細胞跟碎屑(碎屑是被切掉的fibrin?)
想請問可能的原因和改進方法
雖然種回去還是會慢慢長起來
但本來一盤能收到的細胞數就很少了
還死很多 長的又慢 好難做實驗QQ
以下附上培養跟操作的condition和protocol!
培養盤:10cm falcon dish
0.05% Trypsin-EDTA
0.08% Trypan blue in PBS
PBS
大概養到8-9成滿就會繼代
2ml PBS wash 2次後加入2ml 0.05% Trypsin-EDTA
來回Rinse約10秒後吸除Trypsin
室溫作用大約3分鐘
在顯微鏡下觀察細胞變亮，貼盤的纖維都切除為止
用Medium中和並冲下細胞後以1250rpm,5分鐘離心
去除上清液，加入1ml medium輕pipette約15次打散細胞進行計數
有試過用0.025% Trypsin以及
更溫和的Dissociation reagent(Accutase)
但都沒有好轉的現象
想請問有培養過這株細胞的前輩們分享你們培養時的條件
萬分感謝！
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1F：→ xuyxup192224: 為何要先吸去Trypsin?這樣整盤幹幹的細胞本來就容 11/09 23:15
2F：→ xuyxup192224: 易死 11/09 23:15
倒是沒有想到會乾掉的問題 謝謝提醒!
後來用Accutase的時候有把1.5ml留在dish內
3F：→ xuyxup192224: 加trypsin反應，拍一拍細胞有浮起來加入medium/PBS 11/09 23:18
4F：→ xuyxup192224: pipetting將cell sol.移到離心管即可，不用先將tr 11/09 23:18
5F：→ xuyxup192224: ypsin吸去 11/09 23:18
我會試試看 因為我看ATCC對每個細胞的Trypsin時間都說5-15分鐘...
說不定3分鐘的Trypsin都還嫌太久了!
6F：→ xuyxup192224: 建議你再看一下ATCC的subculture的步驟https://www 11/09 23:27
7F：→ xuyxup192224: .atcc.org/products/all/CCL-171.aspx 11/09 23:27
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:00:31
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:02:44
9F：推 tynse71864: trypsin應該都加下去放37度幾分鐘吧 吸掉後又放37度 11/11 18:44
10F：→ tynse71864: 超快乾的 11/11 18:44
11F：推 michealking: 通常都是trypsin 37度5分鐘 12/27 11:50
12F：→ michealking: 拍一拍有下來用至少3倍medium中和 12/27 11:51
13F：推 seanrex: 細胞來自ATCC或BCRC？我們也有遇到類似問題，但BCRC的細 01/03 10:25
14F：→ seanrex: 胞脆弱很多，ATCC至少比較耐Trypsin，不過後來都改成Accu 01/03 10:25
15F：→ seanrex: tase了 01/03 10:25