作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
标题[求救] MRC-5 trypsinize後存活不佳
时间Mon Nov 9 22:02:03 2020
大家好 不好意思又来打扰
最近开始养MRC-5这株Lung fibroblast
Medium的成分都是完全参照ATCC
养起来型态都挺正常的
(就是癌细胞养惯了觉得长的好慢)
只是在Trypsinized後染Trypan blue
都会有很多死细胞跟碎屑(碎屑是被切掉的fibrin?)
想请问可能的原因和改进方法
虽然种回去还是会慢慢长起来
但本来一盘能收到的细胞数就很少了
还死很多 长的又慢 好难做实验QQ
以下附上培养跟操作的condition和protocol!
培养盘:10cm falcon dish
0.05% Trypsin-EDTA
0.08% Trypan blue in PBS
PBS
大概养到8-9成满就会继代
2ml PBS wash 2次後加入2ml 0.05% Trypsin-EDTA
来回Rinse约10秒後吸除Trypsin
室温作用大约3分钟
在显微镜下观察细胞变亮，贴盘的纤维都切除为止
用Medium中和并冲下细胞後以1250rpm,5分钟离心
去除上清液，加入1ml medium轻pipette约15次打散细胞进行计数
有试过用0.025% Trypsin以及
更温和的Dissociation reagent(Accutase)
但都没有好转的现象
想请问有培养过这株细胞的前辈们分享你们培养时的条件
万分感谢！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.126.50.146 (台湾)
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1F：→ xuyxup192224: 为何要先吸去Trypsin?这样整盘干干的细胞本来就容 11/09 23:15
2F：→ xuyxup192224: 易死 11/09 23:15
倒是没有想到会乾掉的问题 谢谢提醒!
後来用Accutase的时候有把1.5ml留在dish内
3F：→ xuyxup192224: 加trypsin反应，拍一拍细胞有浮起来加入medium/PBS 11/09 23:18
4F：→ xuyxup192224: pipetting将cell sol.移到离心管即可，不用先将tr 11/09 23:18
5F：→ xuyxup192224: ypsin吸去 11/09 23:18
我会试试看 因为我看ATCC对每个细胞的Trypsin时间都说5-15分钟...
说不定3分钟的Trypsin都还嫌太久了!
6F：→ xuyxup192224: 建议你再看一下ATCC的subculture的步骤https://www 11/09 23:27
7F：→ xuyxup192224: .atcc.org/products/all/CCL-171.aspx 11/09 23:27
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 11/10/2020 11:00:31
※ 编辑: steve42125 (120.126.50.146 台湾), 11/10/2020 11:02:44
9F：推 tynse71864: trypsin应该都加下去放37度几分钟吧 吸掉後又放37度 11/11 18:44
10F：→ tynse71864: 超快乾的 11/11 18:44
11F：推 michealking: 通常都是trypsin 37度5分钟 12/27 11:50
12F：→ michealking: 拍一拍有下来用至少3倍medium中和 12/27 11:51
13F：推 seanrex: 细胞来自ATCC或BCRC？我们也有遇到类似问题，但BCRC的细 01/03 10:25
14F：→ seanrex: 胞脆弱很多，ATCC至少比较耐Trypsin，不过後来都改成Accu 01/03 10:25
15F：→ seanrex: tase了 01/03 10:25