※ 引述《nm768417 (opport)》之銘言： : 因為構築好的質體之後要來產蛋白 : 但小弟是新手，不確定這樣設計是否會有什麼問題 : 1.會有其他雜band出現嗎？ : 2.我的那段insert前面的T7 promoter因為離insert有點距離，所以我在設計insert的時 : 候， : 前面加了start codon，這樣會有蛋白做不出來的問題嗎？ : 3.圖中的insert大小是414bps，還有另外的是369bps，這樣在跑WB後，跑出來的結果是不 : 是會滿靠近的？ : https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg 唉 還是來回一下好了 也希望能夠幫到各位剛踏入protein expression阿鼻地獄的後進 首先做bacterial (或是其他) expression最先要考慮的就是你最後這個蛋白要幹嘛 這個很大一部分會限制你表現蛋白的方式跟策略 舉例來說你需要做蛋白活性測驗 阿你又不確定蛋白能不能refold 那可能你就得做native state purification, 意思也就是蛋白可能不能太小太soluble promoter可能不能太強 induction不能太熱 codon不能太optimised 不然可能全部會被推進inclusion body 換句話說你如果要做htrf 蛋白不需要太純 那就隨便做沒差 然後勒 絕大多數的情況 你蛋白都要純化 純化有兩個層面 一個是tag/chromatography 一個是competition 首先你希望你的蛋白有很好抓的tag或是特性 再來你希望你的蛋白很多很多 其他的雜蛋白很少很少越少越好 所以才不會來跟你搶你的column或是純化方式嘛 一般來講 第一道純化一定還是雜 還是要過第二道甚至第三道手續 簡單過個gel filtration都好 回來看原po這個例子 第一個是你產蛋白要幹嘛 做elisa/跑膠/跑2D/打老鼠的要求都是不一樣的 再來為什麼要用pET32a 為什麼不用基本款的3a就好 32a的特色是他有一個N-ter的fusion thioredoxin可以幫助protein folding 通常你還得自己放一個切位上去 純化下來之後可以把trx切掉 阿你現在做兩個分開 雖然前面有前輩講只要放個SD sequence上去 細菌是polycistronic所以大概還是express得出來 但是為什麼還要浪費資源去overexpress那個thioredoxin 大概還會比你的protein多 到時候一定都沾在column上面 拎北鐵口直斷 然後你這兩個蛋白mw這麼近 肯定gel filtration拉不開 阿是不是又要再買column 唉 最後提個小弟博班學到的 畢身絕學 跟各位分享 做native state overexpression的話 pET32很不錯啦 trx-His6-TEV site-protein of interest 要自己純化TEV protease, addgene上就有 超好用 還內建histag一步純化 但是如果還是不行 還有大絕招 用intein system, NEB的pTXB1/pTYB1 (addgene也有, 但是可能要自己clone) protein of interest-GyrA chitin column拉下來之後用DTT可以產生auto cleavage, 完全沒有scar 基本上超純 濃縮desalt就好了 給各位參考 -- 人好 欠表 --

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