※ 引述《nm768417 (opport)》之铭言： : 因为构筑好的质体之後要来产蛋白 : 但小弟是新手，不确定这样设计是否会有什麽问题 : 1.会有其他杂band出现吗？ : 2.我的那段insert前面的T7 promoter因为离insert有点距离，所以我在设计insert的时 : 候， : 前面加了start codon，这样会有蛋白做不出来的问题吗？ : 3.图中的insert大小是414bps，还有另外的是369bps，这样在跑WB後，跑出来的结果是不 : 是会满靠近的？ : https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg 唉 还是来回一下好了 也希望能够帮到各位刚踏入protein expression阿鼻地狱的後进 首先做bacterial (或是其他) expression最先要考虑的就是你最後这个蛋白要干嘛 这个很大一部分会限制你表现蛋白的方式跟策略 举例来说你需要做蛋白活性测验 阿你又不确定蛋白能不能refold 那可能你就得做native state purification, 意思也就是蛋白可能不能太小太soluble promoter可能不能太强 induction不能太热 codon不能太optimised 不然可能全部会被推进inclusion body 换句话说你如果要做htrf 蛋白不需要太纯 那就随便做没差 然後勒 绝大多数的情况 你蛋白都要纯化 纯化有两个层面 一个是tag/chromatography 一个是competition 首先你希望你的蛋白有很好抓的tag或是特性 再来你希望你的蛋白很多很多 其他的杂蛋白很少很少越少越好 所以才不会来跟你抢你的column或是纯化方式嘛 一般来讲 第一道纯化一定还是杂 还是要过第二道甚至第三道手续 简单过个gel filtration都好 回来看原po这个例子 第一个是你产蛋白要干嘛 做elisa/跑胶/跑2D/打老鼠的要求都是不一样的 再来为什麽要用pET32a 为什麽不用基本款的3a就好 32a的特色是他有一个N-ter的fusion thioredoxin可以帮助protein folding 通常你还得自己放一个切位上去 纯化下来之後可以把trx切掉 阿你现在做两个分开 虽然前面有前辈讲只要放个SD sequence上去 细菌是polycistronic所以大概还是express得出来 但是为什麽还要浪费资源去overexpress那个thioredoxin 大概还会比你的protein多 到时候一定都沾在column上面 拎北铁口直断 然後你这两个蛋白mw这麽近 肯定gel filtration拉不开 阿是不是又要再买column 唉 最後提个小弟博班学到的 毕身绝学 跟各位分享 做native state overexpression的话 pET32很不错啦 trx-His6-TEV site-protein of interest 要自己纯化TEV protease, addgene上就有 超好用 还内建histag一步纯化 但是如果还是不行 还有大绝招 用intein system, NEB的pTXB1/pTYB1 (addgene也有, 但是可能要自己clone) protein of interest-GyrA chitin column拉下来之後用DTT可以产生auto cleavage, 完全没有scar 基本上超纯 浓缩desalt就好了 给各位参考 -- 人好 欠表 --

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