作者nm768417 (opport)
看板Biotech
標題[求救] 質體設計是否有問題
時間Thu Oct 22 21:37:52 2020
因為構築好的質體之後要來產蛋白
但小弟是新手，不確定這樣設計是否會有什麼問題
1.會有其他雜band出現嗎？
2.我的那段insert前面的T7 promoter因為離insert有點距離，所以我在設計insert的時
候，
前面加了start codon，這樣會有蛋白做不出來的問題嗎？
3.圖中的insert大小是414bps，還有另外的是369bps，這樣在跑WB後，跑出來的結果是不
是會滿靠近的？
https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg
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※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/22/2020 21:42:19
※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/23/2020 01:56:32
※ 編輯: nm768417 (42.73.234.44 臺灣), 10/23/2020 01:57:30
1F：→ xxtomnyxx: 還是那句老話：問問題請把問題描述清楚。 10/23 11:02
2F：→ xxtomnyxx: 1. 雜band？是做什麼實驗的？切 RE？PCR？WB？ 10/23 11:02
3F：→ xxtomnyxx: 2. 你給的圖上沒有T7 promoter(雖然我看的出來在哪裡) 10/23 11:02
4F：→ xxtomnyxx: ，請你標記好。 10/23 11:02
5F：→ xxtomnyxx: 3. 在問這個問題前，你有先去理解過WB的原理嗎？如果 10/23 11:02
6F：→ xxtomnyxx: 有，請問你用什麼一抗？ 10/23 11:02
7F：推 Marriott: 你是有refolding相關需求才用pET32a? 若不是，你要想 10/23 11:02
8F：→ Marriott: 想到時候你目標蛋白N段前面可是會多不少東西啊 （前面 10/23 11:02
9F：→ Marriott: 已經有atg，你加不加都無所謂），到時候還要多一道切的 10/23 11:02
10F：→ Marriott: 步驟 10/23 11:02
11F：→ xxtomnyxx: 如果你希望insert獨立做出一個蛋白，那除了ATG以外還 10/23 11:10
12F：→ xxtomnyxx: 要放Shine-Dalgarno sequence，而且還要放stop codon 10/23 11:10
13F：→ xxtomnyxx: 終止前面TrxA蛋白的轉譯；如果你要做一個insert和TrxA 10/23 11:10
14F：→ xxtomnyxx: 的fusion protein，那加不加ATG都無所謂。 10/23 11:10
15F：→ nm768417: 感謝各位大神回覆，抱歉可能我問題沒有問的很清楚，我 10/23 11:44
16F：→ nm768417: 的質體目的是想做出insert的獨立蛋白，進而表達出抗原然 10/23 11:44
17F：→ nm768417: 後去偵測血清中的抗體，然後有看到回覆的留言，有看到要 10/23 11:44
18F：→ nm768417: 加入shine-dalgarno sequence還有stop codon，我想請問 10/23 11:44
19F：→ nm768417: 一下這個要怎麼加入到insert上，加上去的話的順序是stop 10/23 11:44
20F：→ nm768417: codon-酵素切位-shine-dalgarno sequence-AUG-insert 10/23 11:44
21F：→ nm768417: 嗎，抱歉我是菜鳥大學生 10/23 11:44
22F：→ Ice9: 等等，大學生？實驗室沒有前輩嗎？ 10/23 16:36
23F：→ nm768417: 實驗室沒有碩生跟博生也沒有助理 10/23 17:51
24F：→ Ianthegood: 老闆放生嗎?這大概是碩班題目的難度? 10/23 22:08
25F：推 tynse71864: 等等沒有碩博也沒助理只有專題是怎樣囧 10/24 00:09
26F：→ rebirth: 你要不要換實驗室比較快阿 10/24 10:09
27F：→ rebirth: expression vector基本設計問題實驗室沒人可教只能上網 10/24 10:11
28F：→ rebirth: 問網友... 10/24 10:11
29F：→ tynse71864: 但還是想辦法解決下好了 是說 stop 跟 start codon 10/25 13:06
30F：→ tynse71864: 應該寫反了？ 10/25 13:06
31F：推 tynse71864: 喔我看錯了, 你寫的應該是對的， insert尾巴還要再一 10/25 13:10
32F：→ tynse71864: 個stop。另外跑膠理論上只會有一個 band 但實際上要 10/25 13:10
33F：→ tynse71864: 跑了才知道 10/25 13:10
34F：→ nm768417: 感謝樓上大神指導，那stop codon要怎麼加上去？因為是 10/25 14:29
35F：→ nm768417: 酵素切然後黏上去vector上，這樣不是要加在6-his tag後 10/25 14:29
36F：→ nm768417: 面嗎？ 10/25 14:29
37F：→ xxtomnyxx: 單就這個 vector 的設計和製做大概是大學專題生水準， 10/25 15:16
38F：→ xxtomnyxx: 包含血清測試整套做完差不多就是碩班題目。你現在大幾 10/25 15:17
39F：→ xxtomnyxx: ？原核生物的轉錄轉譯調控學過了嗎？知道 ORF 的 frame 10/25 15:18
40F：→ xxtomnyxx: 是什麼嗎？知道你的程度比較方便告訴你要怎麼做。 10/25 15:19
41F：推 vivitune: 5’-切位-start-你的基因-3’ 10/25 20:02
42F：→ vivitune: 5’-切位-stop-你的基因-3‘ 10/25 20:02
43F：→ Ice9: 問網友反饋花的時間比較長。試試找其他實驗室學長姐會比較 10/25 21:03
44F：→ Ice9: 快。另外，現階段你需要那些背景知識也可以由他們協助。 10/25 21:03
45F：推 rasaze: 良心建議既然實驗室放生你，就放生實驗室吧，把時間拿去 10/31 14:44
46F：→ rasaze: 補充基本知識甚至精進英文也比在這間實驗室浪費時間好 10/31 14:44