作者nm768417 (opport)
看板Biotech
标题[求救] 质体设计是否有问题
时间Thu Oct 22 21:37:52 2020
因为构筑好的质体之後要来产蛋白
但小弟是新手，不确定这样设计是否会有什麽问题
1.会有其他杂band出现吗？
2.我的那段insert前面的T7 promoter因为离insert有点距离，所以我在设计insert的时
候，
前面加了start codon，这样会有蛋白做不出来的问题吗？
3.图中的insert大小是414bps，还有另外的是369bps，这样在跑WB後，跑出来的结果是不
是会满靠近的？
https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg
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※ 编辑: nm768417 (42.73.234.44 台湾), 10/22/2020 21:42:19
※ 编辑: nm768417 (42.73.234.44 台湾), 10/23/2020 01:56:32
※ 编辑: nm768417 (42.73.234.44 台湾), 10/23/2020 01:57:30
1F：→ xxtomnyxx: 还是那句老话：问问题请把问题描述清楚。 10/23 11:02
2F：→ xxtomnyxx: 1. 杂band？是做什麽实验的？切 RE？PCR？WB？ 10/23 11:02
3F：→ xxtomnyxx: 2. 你给的图上没有T7 promoter(虽然我看的出来在哪里) 10/23 11:02
4F：→ xxtomnyxx: ，请你标记好。 10/23 11:02
5F：→ xxtomnyxx: 3. 在问这个问题前，你有先去理解过WB的原理吗？如果 10/23 11:02
6F：→ xxtomnyxx: 有，请问你用什麽一抗？ 10/23 11:02
7F：推 Marriott: 你是有refolding相关需求才用pET32a? 若不是，你要想 10/23 11:02
8F：→ Marriott: 想到时候你目标蛋白N段前面可是会多不少东西啊 （前面 10/23 11:02
9F：→ Marriott: 已经有atg，你加不加都无所谓），到时候还要多一道切的 10/23 11:02
10F：→ Marriott: 步骤 10/23 11:02
11F：→ xxtomnyxx: 如果你希望insert独立做出一个蛋白，那除了ATG以外还 10/23 11:10
12F：→ xxtomnyxx: 要放Shine-Dalgarno sequence，而且还要放stop codon 10/23 11:10
13F：→ xxtomnyxx: 终止前面TrxA蛋白的转译；如果你要做一个insert和TrxA 10/23 11:10
14F：→ xxtomnyxx: 的fusion protein，那加不加ATG都无所谓。 10/23 11:10
15F：→ nm768417: 感谢各位大神回覆，抱歉可能我问题没有问的很清楚，我 10/23 11:44
16F：→ nm768417: 的质体目的是想做出insert的独立蛋白，进而表达出抗原然 10/23 11:44
17F：→ nm768417: 後去侦测血清中的抗体，然後有看到回覆的留言，有看到要 10/23 11:44
18F：→ nm768417: 加入shine-dalgarno sequence还有stop codon，我想请问 10/23 11:44
19F：→ nm768417: 一下这个要怎麽加入到insert上，加上去的话的顺序是stop 10/23 11:44
20F：→ nm768417: codon-酵素切位-shine-dalgarno sequence-AUG-insert 10/23 11:44
21F：→ nm768417: 吗，抱歉我是菜鸟大学生 10/23 11:44
22F：→ Ice9: 等等，大学生？实验室没有前辈吗？ 10/23 16:36
23F：→ nm768417: 实验室没有硕生跟博生也没有助理 10/23 17:51
24F：→ Ianthegood: 老板放生吗?这大概是硕班题目的难度? 10/23 22:08
25F：推 tynse71864: 等等没有硕博也没助理只有专题是怎样囧 10/24 00:09
26F：→ rebirth: 你要不要换实验室比较快阿 10/24 10:09
27F：→ rebirth: expression vector基本设计问题实验室没人可教只能上网 10/24 10:11
28F：→ rebirth: 问网友... 10/24 10:11
29F：→ tynse71864: 但还是想办法解决下好了 是说 stop 跟 start codon 10/25 13:06
30F：→ tynse71864: 应该写反了？ 10/25 13:06
31F：推 tynse71864: 喔我看错了, 你写的应该是对的， insert尾巴还要再一 10/25 13:10
32F：→ tynse71864: 个stop。另外跑胶理论上只会有一个 band 但实际上要 10/25 13:10
33F：→ tynse71864: 跑了才知道 10/25 13:10
34F：→ nm768417: 感谢楼上大神指导，那stop codon要怎麽加上去？因为是 10/25 14:29
35F：→ nm768417: 酵素切然後黏上去vector上，这样不是要加在6-his tag後 10/25 14:29
36F：→ nm768417: 面吗？ 10/25 14:29
37F：→ xxtomnyxx: 单就这个 vector 的设计和制做大概是大学专题生水准， 10/25 15:16
38F：→ xxtomnyxx: 包含血清测试整套做完差不多就是硕班题目。你现在大几 10/25 15:17
39F：→ xxtomnyxx: ？原核生物的转录转译调控学过了吗？知道 ORF 的 frame 10/25 15:18
40F：→ xxtomnyxx: 是什麽吗？知道你的程度比较方便告诉你要怎麽做。 10/25 15:19
41F：推 vivitune: 5’-切位-start-你的基因-3’ 10/25 20:02
42F：→ vivitune: 5’-切位-stop-你的基因-3‘ 10/25 20:02
43F：→ Ice9: 问网友反馈花的时间比较长。试试找其他实验室学长姐会比较 10/25 21:03
44F：→ Ice9: 快。另外，现阶段你需要那些背景知识也可以由他们协助。 10/25 21:03
45F：推 rasaze: 良心建议既然实验室放生你，就放生实验室吧，把时间拿去 10/31 14:44
46F：→ rasaze: 补充基本知识甚至精进英文也比在这间实验室浪费时间好 10/31 14:44