作者janewu945 (I am who I am)
看板Biotech
標題[求救]
時間Mon Sep 14 23:02:41 2020
小妹上次的vector 重新跑之後就沒有雙band 的問題
但是在做ligations 卻出現跟之前一樣狀況
Ligations 完後跑NdeI&XhoI去確認insert 是否有進去
預期位置是6000bp 與1500bp
卻跑出來4000bp的位置且沒有切出東西
https://i.imgur.com/im1xZAJ.jpg
實驗順序
Vector
Re digestion(incubate 37C 1hr)>
gel extraction >
CIP(37C 10min , 80C 2min) >
T4 ligations (RT10min)
Insert
PCR >
Gel extraction >
RE Digestion(incubate 37C 1hr)>
Gel extraction >
T4 ligations
在ligations前 跑膠位置都正確
現在只有想到是問題狀況是
1.transform不完全導致後面ligations 出問題
2.ligations 時間太少（依照NEB Protocol)
3.前面NdeI的RE digestion 時間需要更長（2hr up?)
我很想送定序但老闆只要聽到定序兩個字就會炸掉QQ
想問看看大家做實驗的狀況
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.12.192.114 (臺灣)
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※ 編輯: janewu945 (101.12.192.114 臺灣), 09/14/2020 23:03:06
1F：→ Ianthegood: 所以你到底是ligate完跑膠還是ligation/transformation/RE完跑膠啊
我看不懂 09/15 00:09
實驗順序都是在ligation前，之後再做transformation
※ 編輯: janewu945 (220.133.82.62 臺灣), 09/15/2020 00:28:28
2F：→ Ianthegood: 所以你為什麼不transform啊 09/15 02:42
3F：推 monkey60391: 同意樓上，不是應該ligation完直接transform，挑col 09/15 04:16
4F：→ monkey60391: ony抽plasmid出來RE跑膠嗎 09/15 04:16
5F：推 monkey60391: 以前做T4 ligation都是放16 ℃ o/n 09/15 04:20
6F：推 turtle24: 挑完菌再切吧，然後建議選別的切位測試 09/15 12:43
7F：→ turtle24: ligation的產物又切同樣酵素不就insert跟vector混合物 09/15 12:44
8F：→ turtle24: 嗎 09/15 12:44
9F：→ blence: T4接完如果可以讓你看到這麼多circular,那幹嘛用這麼多DNA 09/15 13:01
10F：→ blence: 去做,只要picogram的量就夠了阿 09/15 13:01
11F：→ xxtomnyxx: 晚點有時間的話我回一篇好了，妳的實驗設計漏了不少東 09/15 14:29
12F：→ xxtomnyxx: 西，看這結果很難回答出什麼。 09/15 14:29
13F：→ Ice9: Insert 在 PCR完後過column先切，不要跑膠後再切又再跑膠收 09/20 18:44
14F：→ Ice9: 集。 09/20 18:44