作者janewu945 (I am who I am)
看板Biotech
标题[求救]
时间Mon Sep 14 23:02:41 2020
小妹上次的vector 重新跑之後就没有双band 的问题
但是在做ligations 却出现跟之前一样状况
Ligations 完後跑NdeI&XhoI去确认insert 是否有进去
预期位置是6000bp 与1500bp
却跑出来4000bp的位置且没有切出东西
https://i.imgur.com/im1xZAJ.jpg
实验顺序
Vector
Re digestion(incubate 37C 1hr)>
gel extraction >
CIP(37C 10min , 80C 2min) >
T4 ligations (RT10min)
Insert
PCR >
Gel extraction >
RE Digestion(incubate 37C 1hr)>
Gel extraction >
T4 ligations
在ligations前 跑胶位置都正确
现在只有想到是问题状况是
1.transform不完全导致後面ligations 出问题
2.ligations 时间太少（依照NEB Protocol)
3.前面NdeI的RE digestion 时间需要更长（2hr up?)
我很想送定序但老板只要听到定序两个字就会炸掉QQ
想问看看大家做实验的状况
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 101.12.192.114 (台湾)
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1600095763.A.C6B.html
※ 编辑: janewu945 (101.12.192.114 台湾), 09/14/2020 23:03:06
1F：→ Ianthegood: 所以你到底是ligate完跑胶还是ligation/transformation/RE完跑胶啊
我看不懂 09/15 00:09
实验顺序都是在ligation前，之後再做transformation
※ 编辑: janewu945 (220.133.82.62 台湾), 09/15/2020 00:28:28
2F：→ Ianthegood: 所以你为什麽不transform啊 09/15 02:42
3F：推 monkey60391: 同意楼上，不是应该ligation完直接transform，挑col 09/15 04:16
4F：→ monkey60391: ony抽plasmid出来RE跑胶吗 09/15 04:16
5F：推 monkey60391: 以前做T4 ligation都是放16 ℃ o/n 09/15 04:20
6F：推 turtle24: 挑完菌再切吧，然後建议选别的切位测试 09/15 12:43
7F：→ turtle24: ligation的产物又切同样酵素不就insert跟vector混合物 09/15 12:44
8F：→ turtle24: 吗 09/15 12:44
9F：→ blence: T4接完如果可以让你看到这麽多circular,那干嘛用这麽多DNA 09/15 13:01
10F：→ blence: 去做,只要picogram的量就够了阿 09/15 13:01
11F：→ xxtomnyxx: 晚点有时间的话我回一篇好了，你的实验设计漏了不少东 09/15 14:29
12F：→ xxtomnyxx: 西，看这结果很难回答出什麽。 09/15 14:29
13F：→ Ice9: Insert 在 PCR完後过column先切，不要跑胶後再切又再跑胶收 09/20 18:44
14F：→ Ice9: 集。 09/20 18:44