作者nm768417 (opport)
看板Biotech
標題質體
時間Wed Aug 19 16:25:38 2020
小弟我最近把我要的insert成功轉到vector上，但後來我要開始準備純化的東西，發現我
的insert N端掛了his-tag，然後vector上C端也有his-tag，不知是否會影響蛋白表現或
者是更後面的血清學測試
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1F：推 ABULA666: 看paper之前有沒有人這樣做過 ，還有表現出來的protei 08/19 16:38
2F：→ ABULA666: n的activation site是否在附近，真的沒資料可查保險一 08/19 16:38
3F：→ ABULA666: 點把tag拿掉接著做下去，有餘力可以順便比較有無tag的 08/19 16:38
4F：→ ABULA666: 優劣處。 08/19 16:38
5F：→ nm768417: 感謝大大回覆，那拿掉有什麼方法可以做嗎？ 08/19 16:54
6F：推 Ianthegood: scarless cloning 08/19 21:39
7F：推 jabari: \吉噗森/ 08/19 22:50
8F：→ Ianthegood: doi.org/10.17863/CAM.45825 不才小弟剛好博論有一章 08/20 01:45
9F：→ Ianthegood: 講這個 歡迎使用 第四章 08/20 01:45
10F：推 osla30: site-directed mutagenesis 08/20 12:34
11F：→ Ianthegood: 如果實驗室還沒有建立gibson/sdm的話 建議用SLIC啦 08/20 18:22
12F：→ Ianthegood: 便宜又好用 詳情請參上面留言 08/20 18:23
13F：推 jabari: 我是跟NEB要了根試用..省省的就作了10個Clone. 08/20 18:56
14F：推 osla30: NEB的SDM很快，而且幾乎不會失敗，另外KLD可以自己配XD 08/20 19:09
15F：→ osla30: SLIC的話，可google關鍵字"HAC"，五分鐘內搞定 08/20 19:14
16F：→ osla30: 連T4pol都不想買的話，in vivo assembly，全都讓E.coli幫 08/20 19:16
17F：→ osla30: 你代工 08/20 19:16
18F：→ osla30: 關鍵字"AQUA cloning"，不過全E.coli代工的話效率較差就 08/20 19:18
19F：→ osla30: 是了 08/20 19:18
20F：→ Ianthegood: 也是怕self ligation 我用的心得是gibson放幾個月後fa 08/20 19:18
21F：→ Ianthegood: lse positive忽然變超高 滿盤全部都是blank 08/20 19:18
22F：推 osla30: gibson的話也有modified版，關鍵字"Hot Fusion"，少了Ta 08/20 20:56
23F：→ osla30: q ligase，成本省很多 08/20 20:56
24F：→ osla30: 該篇作者也說false positive降很多，重點是便宜很多XD 08/20 20:58
25F：推 Ianthegood: 其實t4p很強而且沒有strand replacement 做完anneal再 08/20 21:09
26F：→ Ianthegood: 丟dNTP就開始fill in了 08/20 21:09
27F：推 osla30: HAC那篇也超快，T4p一分鐘，EDTA stop，anneal一分鐘，送 08/20 21:39
28F：→ osla30: 細菌，交給細菌補gap…XD 08/20 21:39
29F：推 osla30: insert不多的話，SLIC真的好用XD 08/20 21:42
30F：→ Qaaaa: 除非這ligation很難做 不然重P一下在黏回去可能最簡單 08/20 22:55
31F：推 tynse71864: 是說如果 insert自帶 stop codon, 那根本不用管C-ter 08/21 01:42
32F：→ tynse71864: 的his吧? 08/21 01:42
33F：→ nm768417: 我construction 做了七次，是真的有點難做，但指導教授 08/21 02:29
34F：→ nm768417: 說我的insert的頭如果是ATG（蛋白質MET)的話，其實沒什 08/21 02:29
35F：→ nm768417: 麼影響，這我不知道是不是真的XD 08/21 02:29
36F：推 osla30: 其實你玩過一次seamless cloning就不會想再用RE切黏了， 08/21 06:24
37F：→ osla30: 很難失敗 08/21 06:24
38F：推 osla30: 無論Gibson、Infusion、LIC、SLIC、OEC、CPEC、IVA，都是 08/21 06:32
39F：→ osla30: overlap15~25bp去黏，比起RE短短的切位黏，成功率高太多 08/21 06:32
40F：→ osla30: 了 08/21 06:32
41F：→ xxtomnyxx: 主要是受惠於現在 1. 引子便宜的跟水一樣 2. 現今的 08/21 16:10
42F：→ xxtomnyxx: PCR 用 high-fidelity DNA polymerase 便宜又幾乎不出 08/21 16:11
43F：→ xxtomnyxx: 錯，不像以前標榜 HF 還是錯一堆。 08/21 16:12
44F：→ xxtomnyxx: 可是在傳統 RE 法長大的教授和一些學生還是會覺得 PCR 08/21 16:13
45F：→ xxtomnyxx: 做的東西不定序不安心，而且 RE 還是比新一代的方法便 08/21 16:13
46F：→ xxtomnyxx: 宜很多(雖然要看用什麼RE)，單純的把 insert 從A質體換 08/21 16:14
47F：→ xxtomnyxx: 到B質體也是RE比較安定。 08/21 16:15
48F：推 Ianthegood: 借問x大 哪家的hifi便宜啊XD 08/21 16:57
49F：推 tynse71864: 自己覺得 KOD便宜大碗 (？) 08/21 18:36
50F：推 osla30: 的確，不過有的老教授那種先TA挑數十顆菌，再轉RE挑數十 08/21 22:52
51F：→ osla30: 顆菌，切O/N，ligationO/N的，那個花費的時間與消耗的其 08/21 22:52
52F：→ osla30: 他耗材，我是覺得沒便宜到哪裡就是了XD 08/21 22:52
53F：→ xxtomnyxx: RE我也還是習慣o/n，雖然測過知道10～30分就夠了但是 08/22 02:34
54F：→ xxtomnyxx: 還是不切整晚不安心XD，ligation倒是室溫十幾分就拿去 08/22 02:34
55F：→ xxtomnyxx: 轉了。HF pol 我家用Phusion不算便宜，我說便宜是和7 08/22 02:34
56F：→ xxtomnyxx: 、8年前比，我個人覺得HF pol 是很神奇的，每個人用起 08/22 02:34
57F：→ xxtomnyxx: 來覺得好用的可能都不一樣w 08/22 02:34
58F：推 jabari: 有錢當然直接畫好map叫公司合成啊XD 太長的我還是覺得用RE 08/23 03:57
59F：→ jabari: 比較穩. 我反而覺得切快一點 ligation丟4度o/n感覺比較舒 08/23 03:57
60F：→ jabari: 服(懶).. HF我覺得AccuPrim很棒啊 Phusion跟我tone不合XD 08/23 03:57