作者nm768417 (opport)
看板Biotech
标题质体
时间Wed Aug 19 16:25:38 2020
小弟我最近把我要的insert成功转到vector上，但後来我要开始准备纯化的东西，发现我
的insert N端挂了his-tag，然後vector上C端也有his-tag，不知是否会影响蛋白表现或
者是更後面的血清学测试
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1F：推 ABULA666: 看paper之前有没有人这样做过 ，还有表现出来的protei 08/19 16:38
2F：→ ABULA666: n的activation site是否在附近，真的没资料可查保险一 08/19 16:38
3F：→ ABULA666: 点把tag拿掉接着做下去，有余力可以顺便比较有无tag的 08/19 16:38
4F：→ ABULA666: 优劣处。 08/19 16:38
5F：→ nm768417: 感谢大大回覆，那拿掉有什麽方法可以做吗？ 08/19 16:54
6F：推 Ianthegood: scarless cloning 08/19 21:39
7F：推 jabari: \吉噗森/ 08/19 22:50
8F：→ Ianthegood: doi.org/10.17863/CAM.45825 不才小弟刚好博论有一章 08/20 01:45
9F：→ Ianthegood: 讲这个 欢迎使用 第四章 08/20 01:45
10F：推 osla30: site-directed mutagenesis 08/20 12:34
11F：→ Ianthegood: 如果实验室还没有建立gibson/sdm的话 建议用SLIC啦 08/20 18:22
12F：→ Ianthegood: 便宜又好用 详情请参上面留言 08/20 18:23
13F：推 jabari: 我是跟NEB要了根试用..省省的就作了10个Clone. 08/20 18:56
14F：推 osla30: NEB的SDM很快，而且几乎不会失败，另外KLD可以自己配XD 08/20 19:09
15F：→ osla30: SLIC的话，可google关键字"HAC"，五分钟内搞定 08/20 19:14
16F：→ osla30: 连T4pol都不想买的话，in vivo assembly，全都让E.coli帮 08/20 19:16
17F：→ osla30: 你代工 08/20 19:16
18F：→ osla30: 关键字"AQUA cloning"，不过全E.coli代工的话效率较差就 08/20 19:18
19F：→ osla30: 是了 08/20 19:18
20F：→ Ianthegood: 也是怕self ligation 我用的心得是gibson放几个月後fa 08/20 19:18
21F：→ Ianthegood: lse positive忽然变超高 满盘全部都是blank 08/20 19:18
22F：推 osla30: gibson的话也有modified版，关键字"Hot Fusion"，少了Ta 08/20 20:56
23F：→ osla30: q ligase，成本省很多 08/20 20:56
24F：→ osla30: 该篇作者也说false positive降很多，重点是便宜很多XD 08/20 20:58
25F：推 Ianthegood: 其实t4p很强而且没有strand replacement 做完anneal再 08/20 21:09
26F：→ Ianthegood: 丢dNTP就开始fill in了 08/20 21:09
27F：推 osla30: HAC那篇也超快，T4p一分钟，EDTA stop，anneal一分钟，送 08/20 21:39
28F：→ osla30: 细菌，交给细菌补gap…XD 08/20 21:39
29F：推 osla30: insert不多的话，SLIC真的好用XD 08/20 21:42
30F：→ Qaaaa: 除非这ligation很难做 不然重P一下在黏回去可能最简单 08/20 22:55
31F：推 tynse71864: 是说如果 insert自带 stop codon, 那根本不用管C-ter 08/21 01:42
32F：→ tynse71864: 的his吧? 08/21 01:42
33F：→ nm768417: 我construction 做了七次，是真的有点难做，但指导教授 08/21 02:29
34F：→ nm768417: 说我的insert的头如果是ATG（蛋白质MET)的话，其实没什 08/21 02:29
35F：→ nm768417: 麽影响，这我不知道是不是真的XD 08/21 02:29
36F：推 osla30: 其实你玩过一次seamless cloning就不会想再用RE切黏了， 08/21 06:24
37F：→ osla30: 很难失败 08/21 06:24
38F：推 osla30: 无论Gibson、Infusion、LIC、SLIC、OEC、CPEC、IVA，都是 08/21 06:32
39F：→ osla30: overlap15~25bp去黏，比起RE短短的切位黏，成功率高太多 08/21 06:32
40F：→ osla30: 了 08/21 06:32
41F：→ xxtomnyxx: 主要是受惠於现在 1. 引子便宜的跟水一样 2. 现今的 08/21 16:10
42F：→ xxtomnyxx: PCR 用 high-fidelity DNA polymerase 便宜又几乎不出 08/21 16:11
43F：→ xxtomnyxx: 错，不像以前标榜 HF 还是错一堆。 08/21 16:12
44F：→ xxtomnyxx: 可是在传统 RE 法长大的教授和一些学生还是会觉得 PCR 08/21 16:13
45F：→ xxtomnyxx: 做的东西不定序不安心，而且 RE 还是比新一代的方法便 08/21 16:13
46F：→ xxtomnyxx: 宜很多(虽然要看用什麽RE)，单纯的把 insert 从A质体换 08/21 16:14
47F：→ xxtomnyxx: 到B质体也是RE比较安定。 08/21 16:15
48F：推 Ianthegood: 借问x大 哪家的hifi便宜啊XD 08/21 16:57
49F：推 tynse71864: 自己觉得 KOD便宜大碗 (？) 08/21 18:36
50F：推 osla30: 的确，不过有的老教授那种先TA挑数十颗菌，再转RE挑数十 08/21 22:52
51F：→ osla30: 颗菌，切O/N，ligationO/N的，那个花费的时间与消耗的其 08/21 22:52
52F：→ osla30: 他耗材，我是觉得没便宜到哪里就是了XD 08/21 22:52
53F：→ xxtomnyxx: RE我也还是习惯o/n，虽然测过知道10～30分就够了但是 08/22 02:34
54F：→ xxtomnyxx: 还是不切整晚不安心XD，ligation倒是室温十几分就拿去 08/22 02:34
55F：→ xxtomnyxx: 转了。HF pol 我家用Phusion不算便宜，我说便宜是和7 08/22 02:34
56F：→ xxtomnyxx: 、8年前比，我个人觉得HF pol 是很神奇的，每个人用起 08/22 02:34
57F：→ xxtomnyxx: 来觉得好用的可能都不一样w 08/22 02:34
58F：推 jabari: 有钱当然直接画好map叫公司合成啊XD 太长的我还是觉得用RE 08/23 03:57
59F：→ jabari: 比较稳. 我反而觉得切快一点 ligation丢4度o/n感觉比较舒 08/23 03:57
60F：→ jabari: 服(懒).. HF我觉得AccuPrim很棒啊 Phusion跟我tone不合XD 08/23 03:57