作者derren (我想要ㄉ幸福M)
看板Biotech
標題[求救] WB 有半邊的band會消失
時間Fri Aug 7 16:43:35 2020
求救版上的大大們
最近做了幾次WB都是不同sample來自動物或細胞,用濕式transfer
但都遇到同樣的問題
如圖
https://imgur.com/a/w6eY5lN
有一個target右半邊大約從well 6-7地方 (10 well)開始的band都會消失
甚至有一個actin 在well 7的地方也變弱(如exp4)，
想請問大大有可能是哪裡出了問題呢?
跪求各位大大解答 感謝~~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.125.14 (臺灣)
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1596789819.A.1AF.html
1F：推 ampicillin: 沒夾緊，不然就是夾太緊 08/07 18:07
2F：推 Ianthegood: 確定不是expression下降？actin看起來滿好的啊 08/07 19:33
3F：推 allmighty: blocking前染個ponceau s看看transfer的效果？ 08/07 19:38
4F：推 allmighty: 還有要確認hy抗體時是否有沒泡到的地方 邊邊角角之類 08/07 19:41
5F：→ allmighty: 的 08/07 19:41
6F：推 lemonteas: 之前有遇過目標蛋白大於100kDa，如果一次磨很多sample 08/07 20:14
7F：→ lemonteas: ，越後面磨的band會越淡。但是小分子的internal contro 08/07 20:14
8F：→ lemonteas: l和ponceau s看不出差別。之後每磨好一個sample就丟到- 08/07 20:14
9F：→ lemonteas: 20度，全部磨完再一起煮，就沒有這個問題了。 08/07 20:14
10F：→ lemonteas: 更正，越早磨的越淡 08/07 20:19
11F：推 Ianthegood: 樓上有放protease inhibitor?還是什麼奇妙的post-tran 08/08 16:23
12F：→ Ianthegood: slational mod 08/08 16:23
13F：→ lemonteas: 對~~沒有放protease inhibitor，只有加sample buffer。 08/09 18:12
14F：→ lemonteas: 我當初猜比較早磨的蛋白會被降解，所以丟-20，但不知道 08/09 18:12
15F：→ lemonteas: 為什麼這個現象在大分子蛋白特別明顯 08/09 18:12