作者len851002 (Nick)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白質電泳問題
時間Wed Jul 1 12:11:49 2020
小弟我construct了兩組clone，gene片段來自細菌，已經完成定序了，核對後序列無誤。
接著我把他transform到BL21(DE3)中表現protein做IPTG induction。
然後破菌去跑SDS page。
但問題來了，我跑出來的protein位置與我predict的位置不一樣
這組clone N端帶His，predict大概32 kDa(有加His的大小)，可是跑出來大概有50 kDa
，如圖
https://imgur.com/dysBgBd
這是coomassie blue stain的結果
這是其中一組的data，另外一組clone也是一樣的問題，predict約98kDa，
但結果卻在110~120kDa左右。
煩請各位大大救我~~
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1F：推 bob79620: 每個Lane label一下，不然有點難幫忙 07/01 15:09
2F：推 bob79620: 然後vector試用哪個？ 07/01 15:11
3F：→ bob79620: *是 07/01 15:12
這是純化後跑SDS page的結果 這組vector是用pET28c 另一組則是用pGEX-4T1
https://i.imgur.com/RPkKJWx.jpg
4F：推 monkey60391: predict不一定準，我純化His tag 蛋白也是差不多會 07/01 15:29
5F：→ monkey60391: 再比原來的蛋白+10 kda 07/01 15:29
不好意思～請問是為什麼呢？
※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:13:07
※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:14:10
※ 編輯: len851002 (180.217.136.86 臺灣), 07/01/2020 16:15:17
7F：→ monkey60391: 可以看一下別人的討論，真的不放心就拿elution或bea 07/01 18:52
8F：→ monkey60391: ds去跑WB壓蛋白本身的抗體或His的抗體看看是不是和c 07/01 18:52
好的 謝謝你 但還是不知道要怎麼用合理的理由跟老師解釋QQ
9F：→ monkey60391: ommassie的位置差不多就知道了 07/01 18:52
10F：→ Qaaaa: 要對map啦 很多vector的tag都不能只加tag的大小 07/01 21:06
11F：→ Qaaaa: 常常會順便帶一堆其他tag 07/01 21:06
我是對map後把片段translate然後去預測kDa的
12F：→ xxtomnyxx: 但白質帶電量也會有影響，根據你SDS-PAGE的系統還會影 07/01 23:13
13F：→ xxtomnyxx: 響marker跑的位置，marker終究只是參考 07/01 23:14
老師好像不太接受這個理由...我想說做到後面測bioactivity就能知道是不是我要的protein了..
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:43:16
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:44:31
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/01/2020 23:45:46
14F：→ milkpa: 用WB確認tag，也有可能是dimer 07/01 23:54
我以為dimer的話會變成兩倍大
15F：→ Ianthegood: 帶電太多的蛋白很容易差很多 07/02 07:14
有辦法知道他是否是帶電太多的蛋白嗎？
16F：→ Ianthegood: 而且你要抓histag 還測activity 你加油 07/02 07:15
17F：→ ganbaba: 通常是post-translational modification造成的 07/02 17:30
應該不是 因為我送到BL21去expression
18F：推 monkey60391: Ecoli作的protein一般不會有PTM 07/02 19:52
對的~謝謝
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:15:47
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:18:44
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:20:54
※ 編輯: len851002 (118.150.133.114 臺灣), 07/02/2020 21:21:59
19F：推 july81212: histag端 pI比一般polypeptide 高結合SDS效率會差一些 07/03 01:02
20F：→ july81212: 這會影響到net charge 07/03 01:02
21F：推 ralph31567: 是不是看一下induce前後的lyse 先確定那個位置是你ind 07/05 13:43
已確認過～確實是induce出來的
22F：→ ralph31567: uce出來的 07/05 13:43
23F：推 bob79620: 用28c的話，想請問一下你cloning進去的sequence有帶sto 07/06 15:17
有的～
24F：→ bob79620: p codon嗎？ 07/06 15:17
25F：推 Ianthegood: 你沒有non-induced control嗎？抓到的很有可能是渣 07/07 06:02
有做過control 與induce相比確實有差
26F：→ Ianthegood: 序列丟protparam看一下pI >10就會慢很多 07/07 06:03
※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:03:47
※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:04:44
※ 編輯: len851002 (110.50.140.46 臺灣), 07/10/2020 22:04:59
27F：推 Ianthegood: 切下來打個ms啊 07/15 15:47
最近要送了～
※ 編輯: len851002 (1.200.202.113 臺灣), 07/16/2020 16:09:13
28F：推 asolitary: 先送MS ID確認是否為你的蛋白~再送SEC MALS 09/19 02:07
29F：→ asolitary: 而且如果蛋白的結構太flexible,page也會跑在不同的地方 09/19 02:08
30F：→ asolitary: 雖然這種情況很少見,但我正在做的project就是如此 09/19 02:09
31F：→ asolitary: 10kDa的蛋白~無論做什麼修改都是跑在40-50kDa之間! 09/19 02:10
32F：推 muscidae: 你知道p53為什麼叫做p53嗎？ 02/05 21:54