作者len851002 (Nick)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白质电泳问题
时间Wed Jul 1 12:11:49 2020
小弟我construct了两组clone，gene片段来自细菌，已经完成定序了，核对後序列无误。
接着我把他transform到BL21(DE3)中表现protein做IPTG induction。
然後破菌去跑SDS page。
但问题来了，我跑出来的protein位置与我predict的位置不一样
这组clone N端带His，predict大概32 kDa(有加His的大小)，可是跑出来大概有50 kDa
，如图
https://imgur.com/dysBgBd
这是coomassie blue stain的结果
这是其中一组的data，另外一组clone也是一样的问题，predict约98kDa，
但结果却在110~120kDa左右。
烦请各位大大救我~~
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1F：推 bob79620: 每个Lane label一下，不然有点难帮忙 07/01 15:09
2F：推 bob79620: 然後vector试用哪个？ 07/01 15:11
3F：→ bob79620: *是 07/01 15:12
这是纯化後跑SDS page的结果 这组vector是用pET28c 另一组则是用pGEX-4T1
https://i.imgur.com/RPkKJWx.jpg
4F：推 monkey60391: predict不一定准，我纯化His tag 蛋白也是差不多会 07/01 15:29
5F：→ monkey60391: 再比原来的蛋白+10 kda 07/01 15:29
不好意思～请问是为什麽呢？
※ 编辑: len851002 (180.217.136.86 台湾), 07/01/2020 16:13:07
※ 编辑: len851002 (180.217.136.86 台湾), 07/01/2020 16:14:10
※ 编辑: len851002 (180.217.136.86 台湾), 07/01/2020 16:15:17
7F：→ monkey60391: 可以看一下别人的讨论，真的不放心就拿elution或bea 07/01 18:52
8F：→ monkey60391: ds去跑WB压蛋白本身的抗体或His的抗体看看是不是和c 07/01 18:52
好的 谢谢你 但还是不知道要怎麽用合理的理由跟老师解释QQ
9F：→ monkey60391: ommassie的位置差不多就知道了 07/01 18:52
10F：→ Qaaaa: 要对map啦 很多vector的tag都不能只加tag的大小 07/01 21:06
11F：→ Qaaaa: 常常会顺便带一堆其他tag 07/01 21:06
我是对map後把片段translate然後去预测kDa的
12F：→ xxtomnyxx: 但白质带电量也会有影响，根据你SDS-PAGE的系统还会影 07/01 23:13
13F：→ xxtomnyxx: 响marker跑的位置，marker终究只是参考 07/01 23:14
老师好像不太接受这个理由...我想说做到後面测bioactivity就能知道是不是我要的protein了..
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/01/2020 23:43:16
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/01/2020 23:44:31
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/01/2020 23:45:46
14F：→ milkpa: 用WB确认tag，也有可能是dimer 07/01 23:54
我以为dimer的话会变成两倍大
15F：→ Ianthegood: 带电太多的蛋白很容易差很多 07/02 07:14
有办法知道他是否是带电太多的蛋白吗？
16F：→ Ianthegood: 而且你要抓histag 还测activity 你加油 07/02 07:15
17F：→ ganbaba: 通常是post-translational modification造成的 07/02 17:30
应该不是 因为我送到BL21去expression
18F：推 monkey60391: Ecoli作的protein一般不会有PTM 07/02 19:52
对的~谢谢
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/02/2020 21:15:47
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/02/2020 21:18:44
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/02/2020 21:20:54
※ 编辑: len851002 (118.150.133.114 台湾), 07/02/2020 21:21:59
19F：推 july81212: histag端 pI比一般polypeptide 高结合SDS效率会差一些 07/03 01:02
20F：→ july81212: 这会影响到net charge 07/03 01:02
21F：推 ralph31567: 是不是看一下induce前後的lyse 先确定那个位置是你ind 07/05 13:43
已确认过～确实是induce出来的
22F：→ ralph31567: uce出来的 07/05 13:43
23F：推 bob79620: 用28c的话，想请问一下你cloning进去的sequence有带sto 07/06 15:17
有的～
24F：→ bob79620: p codon吗？ 07/06 15:17
25F：推 Ianthegood: 你没有non-induced control吗？抓到的很有可能是渣 07/07 06:02
有做过control 与induce相比确实有差
26F：→ Ianthegood: 序列丢protparam看一下pI >10就会慢很多 07/07 06:03
※ 编辑: len851002 (110.50.140.46 台湾), 07/10/2020 22:03:47
※ 编辑: len851002 (110.50.140.46 台湾), 07/10/2020 22:04:44
※ 编辑: len851002 (110.50.140.46 台湾), 07/10/2020 22:04:59
27F：推 Ianthegood: 切下来打个ms啊 07/15 15:47
最近要送了～
※ 编辑: len851002 (1.200.202.113 台湾), 07/16/2020 16:09:13
28F：推 asolitary: 先送MS ID确认是否为你的蛋白~再送SEC MALS 09/19 02:07
29F：→ asolitary: 而且如果蛋白的结构太flexible,page也会跑在不同的地方 09/19 02:08
30F：→ asolitary: 虽然这种情况很少见,但我正在做的project就是如此 09/19 02:09
31F：→ asolitary: 10kDa的蛋白~无论做什麽修改都是跑在40-50kDa之间! 09/19 02:10
32F：推 muscidae: 你知道p53为什麽叫做p53吗？ 02/05 21:54