作者xydream (悠悠)
看板Biotech
標題[求救] Western 條帶反白
時間Wed May 13 16:13:06 2020
代PO
一開始使用1:500濃度的的一抗，曝光時間一分鐘，出來是有東西的
https://i.imgur.com/pOJQykG.png
後來新的一批細胞收下來之後(實驗條件全部相同)，曝光時間才2秒就變這樣QQ，目標蛋
白直接變成白色的，其他分子量的蛋白也是全部反白了
https://i.imgur.com/04djSL0.png
之後在想是不是抗體濃度太高，調整到1:2000，結果還是一樣全部反白
https://i.imgur.com/qdF2hv7.png
實驗條件
蛋白濃度:20mg/ml
垂直式電泳電壓70~120V跑到看到蛋白在底部
Transfer(全濕式)用400mA轉90分鐘，有確定看到prestained marker在膜上
Blocking(5%脫脂奶粉)30分鐘
一抗:用過1:500,1:1000,現在是用1:2000 冰箱搖overnight
PBST wash30分鐘，每10分鐘換一次
二抗:1:1000室溫搖1hr
PBST wash 30分鐘，每10分鐘換一次
用機器壓片，沾ECL，曝光時間從最短1/8秒一路增加到最多2分鐘
想請問各位大大有遇過一直反白的情形嗎，壓不出正常黑色的BAND了
請問這種情況該怎麼解決呢 ?
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1F：→ turtle24: 片子外面是白色的，機器設定反白? 05/13 18:21
2F：→ Sylvaine: 調一下機器設定吧，會不會剛好設定跑掉了沒注意到 05/13 20:29
3F：推 qiet: 軟體設定問題, 自己反相就好了 05/13 20:34
4F：推 jsi: 壓片是指底片嗎? 之前遇過二抗太強，壓底片band反白 05/13 21:52
5F：→ xydream: 壓tubulin是黑的沒問題，應該不是機器設定的問題 05/16 08:42
6F：→ xydream: 更正：不是壓片，是直接把membrane沾好ECL放入機器裡面 05/16 08:47
7F：→ xydream: 調曝光時間然後讓他顯影 05/16 08:47
8F：推 joann88431: 可以稀釋ECL試試看 有時候是band燒掉反白 05/16 12:34
9F：推 bob79620: 感覺像燒掉了 05/16 18:37
10F：→ xydream: 那請問會跟曝光時間有關嗎，還是單純是ECL濃度問題 05/17 00:55
11F：→ xydream: 有試過減短曝光時間，但不是沒東西就是燒掉 05/17 00:55
12F：→ xydream: 我會試試看減少ECL濃度的！感謝 05/17 00:55
13F：→ Sylvaine: 二抗的濃度也可以再調整看看，覺得1:1000有點高 05/17 18:39
14F：推 Ianthegood: 背景全黑也滿妙的 通常二抗沒濃到10倍不會這樣 05/18 16:30
15F：→ xydream: 因為想確認有無東西，拉長曝光時間，然後背景就變黑，蛋 05/18 19:13
16F：→ xydream: 白的位置則是反白QQ 05/18 19:13
17F：推 Ianthegood: 奶粉ok嗎？其他人/抗體也壓成這樣？ 05/18 20:11
19F：→ xydream: 同一片的tubulin是正常的,所以判斷應該不是blocking問題 05/18 22:43
20F：→ antirabbit: 二抗太強了，1:10000很足夠了...... 05/19 16:53
22F：→ xydream: 結果，一樣的問題，不過最底部（分子量最小的地方有黑黑 05/19 18:15
23F：→ xydream: 的band),真的很妙.... 05/19 18:15
24F：推 Ianthegood: 再稀釋 不然用bsa來block看看 05/21 07:00
25F：推 zoom8080: 黑色band是反相後的影像，亮band是原始影像.. 08/28 01:43