作者xydream (悠悠)
看板Biotech
标题[求救] Western 条带反白
时间Wed May 13 16:13:06 2020
代PO
一开始使用1:500浓度的的一抗，曝光时间一分钟，出来是有东西的
https://i.imgur.com/pOJQykG.png
後来新的一批细胞收下来之後(实验条件全部相同)，曝光时间才2秒就变这样QQ，目标蛋
白直接变成白色的，其他分子量的蛋白也是全部反白了
https://i.imgur.com/04djSL0.png
之後在想是不是抗体浓度太高，调整到1:2000，结果还是一样全部反白
https://i.imgur.com/qdF2hv7.png
实验条件
蛋白浓度:20mg/ml
垂直式电泳电压70~120V跑到看到蛋白在底部
Transfer(全湿式)用400mA转90分钟，有确定看到prestained marker在膜上
Blocking(5%脱脂奶粉)30分钟
一抗:用过1:500,1:1000,现在是用1:2000 冰箱摇overnight
PBST wash30分钟，每10分钟换一次
二抗:1:1000室温摇1hr
PBST wash 30分钟，每10分钟换一次
用机器压片，沾ECL，曝光时间从最短1/8秒一路增加到最多2分钟
想请问各位大大有遇过一直反白的情形吗，压不出正常黑色的BAND了
请问这种情况该怎麽解决呢 ?
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1F：→ turtle24: 片子外面是白色的，机器设定反白? 05/13 18:21
2F：→ Sylvaine: 调一下机器设定吧，会不会刚好设定跑掉了没注意到 05/13 20:29
3F：推 qiet: 软体设定问题, 自己反相就好了 05/13 20:34
4F：推 jsi: 压片是指底片吗? 之前遇过二抗太强，压底片band反白 05/13 21:52
5F：→ xydream: 压tubulin是黑的没问题，应该不是机器设定的问题 05/16 08:42
6F：→ xydream: 更正：不是压片，是直接把membrane沾好ECL放入机器里面 05/16 08:47
7F：→ xydream: 调曝光时间然後让他显影 05/16 08:47
8F：推 joann88431: 可以稀释ECL试试看 有时候是band烧掉反白 05/16 12:34
9F：推 bob79620: 感觉像烧掉了 05/16 18:37
10F：→ xydream: 那请问会跟曝光时间有关吗，还是单纯是ECL浓度问题 05/17 00:55
11F：→ xydream: 有试过减短曝光时间，但不是没东西就是烧掉 05/17 00:55
12F：→ xydream: 我会试试看减少ECL浓度的！感谢 05/17 00:55
13F：→ Sylvaine: 二抗的浓度也可以再调整看看，觉得1:1000有点高 05/17 18:39
14F：推 Ianthegood: 背景全黑也满妙的 通常二抗没浓到10倍不会这样 05/18 16:30
15F：→ xydream: 因为想确认有无东西，拉长曝光时间，然後背景就变黑，蛋 05/18 19:13
16F：→ xydream: 白的位置则是反白QQ 05/18 19:13
17F：推 Ianthegood: 奶粉ok吗？其他人/抗体也压成这样？ 05/18 20:11
19F：→ xydream: 同一片的tubulin是正常的,所以判断应该不是blocking问题 05/18 22:43
20F：→ antirabbit: 二抗太强了，1:10000很足够了...... 05/19 16:53
22F：→ xydream: 结果，一样的问题，不过最底部（分子量最小的地方有黑黑 05/19 18:15
23F：→ xydream: 的band),真的很妙.... 05/19 18:15
24F：推 Ianthegood: 再稀释 不然用bsa来block看看 05/21 07:00
25F：推 zoom8080: 黑色band是反相後的影像，亮band是原始影像.. 08/28 01:43