作者hermitwhite (不存在的騎士)
看板Biotech
標題[討論] 某個質體一濃縮就沈澱
時間Mon Feb 3 18:05:01 2020
大家好，我最近在製備送定序用的質體，這個質體約20000 bps，分別以NautiaZ
和GeneMark的kit萃取過，並且最終以純水溶出。但在進一步濃縮的時候遭遇到如下的
狀況：
1. 以帶抽氣和離心功能的濃縮機濃縮時，會在20分鐘內產生白色沈澱，根據測試加熱、
振動、pipetting都無法溶化此沈澱；此現象已被多次再現過
2. 以乾浴槽濃縮時偶會產生沈澱，其發生條件未清楚測試
3. 發生該沈澱之後的溶液仍能以Nanodrop測得DNA，且其濃度隨濃縮增加，但在此同
時，以電泳測試該DNA水溶液會發現偵測到的band在變淡
4. 將已產生該沈澱的DNA溶液丟進Phenol:Choloroform以傳統法跑一遍，產物會直接帶
有沈澱（無法完全溶於水中）
5. 一開始就以傳統法萃取的同一質體不會發生以上現象
6. 雖然遭遇此現象之後並未做過測試比對，不過這是目前本實驗室在濃縮操作中唯一
發生這些狀況的DNA
目前我暫且將乾浴濃縮中沒有發生沈澱的DNA收集起來，成功獲得了足夠送定序的
量，但仍然希望能解開這個謎團（不然我過去半個月花掉的時間就沒有任何價值了）。
不知道有沒有人看過類似的實例，請大家指教。謝謝。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.209.235 (臺灣)
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1580724305.A.03C.html
1F：→ lemonteas: kit有附Elution buffer，為什麼要用水？ 02/03 19:55
2F：→ lemonteas: 按照我的經驗，菌養濃一點，按照kit的protocol操作完， 02/03 20:02
3F：→ lemonteas: 即可送定序，抽出來濃度都有200ng/ul以上。除非有特殊 02/03 20:02
4F：→ lemonteas: 需求，不然好像沒有你操作的那麼複雜，都是隨意抽 02/03 20:02
5F：→ hermitwhite: 該定序單位要求用純水回溶，然後很長的DNA用column回 02/03 21:55
6F：→ hermitwhite: 收率會下降（卡在column上下不來），加上這個質體是 02/03 21:55
7F：→ hermitwhite: low copy number，單純用mini kit照protocol抽出來大 02/03 21:55
8F：→ hermitwhite: 約都會低於40ng/microliter。 02/03 21:56
9F：推 Ianthegood: 個人覺得是protein crap吧 02/03 22:22
其實我自己至今還是不時懷疑這是不是蛋白質，不過除了前述現象以外，還有以
下理由不支持這個假設：
1. Kit本來就不太容易抽出明顯的蛋白質汙染，而在十次以上的萃取中獲得的所有拿
來濃縮的樣本都能再現相同的大量蛋白質汙染可能性太低了。
2. 樣本（濃縮前和濃縮後）過Nanodrop的260/280數值大部分都落在1.4~1.8，且無論
高低，即使拿那一小部分2.0的樣本去濃縮一樣會發生沉澱。
10F：→ turtle24: 有的廠商能用菌液定序，也許可以試試 02/04 10:58
我們之前用的廠商接受菌液菌盤，但這系列實驗送了幾次都收到短且不穩定的結
果，和該公司諸如「由於抽出質體濃度低，我們將再次培養後...」、「由於抽出質體
濃度低，我們將不再做...」之類的來信。實驗室後來就決定這個質體將來都改用另一
家定序，根據經驗定序結果比較長且穩定，但會要你自己製備並濃縮好DNA。
這種情況其實滿常發生的；我們覺得接受菌的廠商可能也就是養出來用kit抽之後
直接定序，只要不是一樓說的那種好抽的質體就不會有太漂亮的結果。
※ 編輯: hermitwhite (1.168.83.14 臺灣), 02/04/2020 14:16:26
11F：→ xxtomnyxx: 要說濃縮質體我會用的方法是酒精沈澱再用少量水回溶， 02/05 05:14
12F：→ xxtomnyxx: 倒是沒試過低溫乾燥 02/05 05:14
13F：→ MADAOTW: 沉澱前後的samples拿去跑膠,分子量一樣嗎？ 02/05 16:33
14F：→ hermitwhite: 分子量一樣，且沒有觀察到明顯的smear。 02/06 21:27
15F：推 Ianthegood: 有nanodrop的spectrum嗎？有的話把kit跟pci抽的都丟上 02/07 07:19
16F：→ Ianthegood: 來大家看看 02/07 07:19
17F：→ hermitwhite: 中間還要繼續定序，之後抽的時候我留一下。 02/07 21:18
18F：→ hitmd: mini kit或許可以換一家試試看? 02/07 23:34
19F：→ hitmd: 拍謝沒有看到想探討此現象的原因 02/07 23:49
20F：推 Alstonia: 好奇最後你有定序成功嗎？你的plasmid有20k,是否有跟廠 02/10 22:31
21F：→ Alstonia: 商說？ 02/10 22:31
22F：推 Alstonia: 不建議你用乾燥的方式濃縮，抽出的的plasmid,多少都有鹽 02/10 22:37
23F：→ Alstonia: 類跟蛋白殘留，你用抽乾的方式會提高鹽類濃度，不利後 02/10 22:37
24F：→ Alstonia: 序定序。 02/10 22:37
25F：推 Alstonia: 20k 的plasmid 你如果沒先說，沒換條件做，保證做不出 02/10 22:40
26F：→ Alstonia: 來的。 02/10 22:40
27F：→ hermitwhite: 累積多次定序有慢慢定出來了，就是濃縮很花時間，然 02/20 01:30
28F：→ hermitwhite: 後kit很貴。這些送定序樣本的資訊我們都有給。 02/20 01:30
29F：→ hermitwhite: 現在這個定序單位對20k plasmid送定序建議的濃度是 02/20 01:32
30F：→ hermitwhite: 500ng/microliter，不濃縮也根本不知道怎麼生出來。 02/20 01:34
31F：→ hermitwhite: 雖然後來還是濃縮到200ng/microliter就送了。 02/20 01:35
※ 編輯: hermitwhite (125.230.16.105 臺灣), 02/20/2020 02:29:25
32F：推 osla30: 是用Terrific Broth養嗎？ 02/24 08:36
33F：→ hermitwhite: 好像是Miller's LB broth。 02/26 13:01
感謝大家的建議。我這陣子又做了一些測試，以下是後來確認的事：
1. 從DH5α和BW25113裡萃取出的同一個質體都有此現象
2. 同系列其他質體沒有發生相同現象，例如說我這個質體是pGETS118+A+B，而
pGETS118+A溶液濃縮不會產生沉澱，長度更長的pGETS118+A+C溶液濃縮也不
會產生沉澱；目前正在試著在後面接其他東西看看
然後以下是幾個樣本的Nanodrop spectrum，因為只是順便紀錄的所以參數
的對照性沒很好。
樣本1. Kit 回收，50 microliter
https://imgur.com/n3bLPnc
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後，產生少量白色沉澱
https://imgur.com/uYKFa9B
樣本2. Kit 回收，50 microliter
https://imgur.com/8Ok4J35
在乾浴槽中70℃烘乾20分鐘後，產生少量白色沉澱
https://imgur.com/77Ihd8M
樣本3. Kit 回收，150 microliter
https://imgur.com/GNrlSFo
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後，產生較大量白色沉澱
https://imgur.com/xeXmWWw
樣本4. Kit 回收，150 microliter
https://imgur.com/WpRR6r9
在減壓濃縮機中60℃烘乾20分鐘後，產生較大量白色沉澱
https://imgur.com/F9Q9cIC
樣本5. 傳統法回收
已回溶後又減壓濃縮了30分鐘以上；未觀察到沉澱
https://imgur.com/OSIEatG
※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 13:26:51
34F：→ blence: 你給的260/280結果跟kit的比很糟,顯示根本不適合傳統回收 02/26 14:07
35F：→ blence: 你應該調整kit的使用,對於low copy,就使用平5~10x的菌量, 02/26 14:13
36F：→ blence: solution I~III也配合調整到2~3X的用量,以達到完全lyse 02/26 14:14
37F：→ blence: 而要純化時,則是把上面放大的體積分次"只"過同一個column 02/26 14:23
38F：→ blence: 這樣就算是low copy,也可以達到一般的濃度 02/26 14:26
39F：→ blence: 還有,對於你提到kit很貴這件事我也存疑,一個mini-prep再怎 02/26 14:31
40F：→ blence: 麼貴,也不會超過一個定序的價格,plasmid好好確認品質再送 02/26 14:34
這個質體的問題不只是low copy number，也包括了質體大回收率低。先前
我們使用midi kit一次抽70mL，單次回溶也最多能回收到60ng/microliter左右
（但前陣子廠商無法供應midi kit所以就改用mini），因此多次溶出或溶出較
大體積後濃縮可能是不可避免的。還是說大質體回收率低這件事能藉由讓column
吸附到承載量上限來突破？
另外kit很貴是把一次會使用四到八個unit算進去，不過這是順便一提，和
問題關係不大就是。
※ 編輯: hermitwhite (1.168.75.50 臺灣), 02/26/2020 15:02:08
41F：→ blence: 既然你都知道是low copy了,怎麼會擔心超過cloumn acpacity 02/26 17:08
42F：→ blence: 一般mini cloumng上限大約20ug,然後low copy plasmid每ml 02/26 17:21
43F：→ blence: 約1ug,所以用10ml以上的pellet去過同一個cloumn綽綽有餘 02/26 17:24
44F：→ blence: 如果你是好幾個column去回收再濃縮,結果自然會很糟 02/26 17:26
45F：→ hermitwhite: 我這裡不是擔心超過capacity，我是問說你是不是覺得 02/26 23:37
46F：→ hermitwhite: 吸附到接近capacity能增加溶出量；看起來是？ 02/26 23:38
47F：→ hermitwhite: 那理論上我換更薄的column來用也是一個辦法？ 02/26 23:43
48F：→ blence: 當然不是！！ 02/27 00:04
49F：→ blence: low copy意味同體積的菌液可能只有平常1/10 plasmid 02/27 00:07
50F：→ blence: ->用平常的體積會導致只有1/10的濃度->濃度低,OD也極不準 02/27 00:07
51F：→ blence: ->但要是配合用1/10體積的水,則elute的效率會極差 02/27 00:10
52F：→ blence: 所以藉由增加plasmid input過cloumn的手段,才能兼顧效率 02/27 00:12
53F：→ blence: cloumn的厚薄跟capacity有關,量都不夠了,用薄的不就更怪 02/27 00:14
54F：推 osla30: 要不要用Terrific Broth養看看？應該會長多一些 02/29 23:55
55F：→ hermitwhite: 感謝，之前不知道Terrific Broth的功能，最近才偶然 03/21 16:51
56F：→ hermitwhite: 看到能增加質體，之後有類似需求會試試看。還有這個 03/21 16:51
57F：→ hermitwhite: 質體現在我都PCR之後送產物去定序了，產量和定序的穩 03/21 16:53
58F：→ hermitwhite: 定性都明顯有比較好。 03/21 16:54
※ 編輯: hermitwhite (36.234.7.166 臺灣), 03/21/2020 16:54:46