作者hermitwhite (不存在的骑士)
看板Biotech
标题[讨论] 某个质体一浓缩就沈淀
时间Mon Feb 3 18:05:01 2020
大家好，我最近在制备送定序用的质体，这个质体约20000 bps，分别以NautiaZ
和GeneMark的kit萃取过，并且最终以纯水溶出。但在进一步浓缩的时候遭遇到如下的
状况：
1. 以带抽气和离心功能的浓缩机浓缩时，会在20分钟内产生白色沈淀，根据测试加热、
振动、pipetting都无法溶化此沈淀；此现象已被多次再现过
2. 以乾浴槽浓缩时偶会产生沈淀，其发生条件未清楚测试
3. 发生该沈淀之後的溶液仍能以Nanodrop测得DNA，且其浓度随浓缩增加，但在此同
时，以电泳测试该DNA水溶液会发现侦测到的band在变淡
4. 将已产生该沈淀的DNA溶液丢进Phenol:Choloroform以传统法跑一遍，产物会直接带
有沈淀（无法完全溶於水中）
5. 一开始就以传统法萃取的同一质体不会发生以上现象
6. 虽然遭遇此现象之後并未做过测试比对，不过这是目前本实验室在浓缩操作中唯一
发生这些状况的DNA
目前我暂且将乾浴浓缩中没有发生沈淀的DNA收集起来，成功获得了足够送定序的
量，但仍然希望能解开这个谜团（不然我过去半个月花掉的时间就没有任何价值了）。
不知道有没有人看过类似的实例，请大家指教。谢谢。
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1F：→ lemonteas: kit有附Elution buffer，为什麽要用水？ 02/03 19:55
2F：→ lemonteas: 按照我的经验，菌养浓一点，按照kit的protocol操作完， 02/03 20:02
3F：→ lemonteas: 即可送定序，抽出来浓度都有200ng/ul以上。除非有特殊 02/03 20:02
4F：→ lemonteas: 需求，不然好像没有你操作的那麽复杂，都是随意抽 02/03 20:02
5F：→ hermitwhite: 该定序单位要求用纯水回溶，然後很长的DNA用column回 02/03 21:55
6F：→ hermitwhite: 收率会下降（卡在column上下不来），加上这个质体是 02/03 21:55
7F：→ hermitwhite: low copy number，单纯用mini kit照protocol抽出来大 02/03 21:55
8F：→ hermitwhite: 约都会低於40ng/microliter。 02/03 21:56
9F：推 Ianthegood: 个人觉得是protein crap吧 02/03 22:22
其实我自己至今还是不时怀疑这是不是蛋白质，不过除了前述现象以外，还有以
下理由不支持这个假设：
1. Kit本来就不太容易抽出明显的蛋白质污染，而在十次以上的萃取中获得的所有拿
来浓缩的样本都能再现相同的大量蛋白质污染可能性太低了。
2. 样本（浓缩前和浓缩後）过Nanodrop的260/280数值大部分都落在1.4~1.8，且无论
高低，即使拿那一小部分2.0的样本去浓缩一样会发生沉淀。
10F：→ turtle24: 有的厂商能用菌液定序，也许可以试试 02/04 10:58
我们之前用的厂商接受菌液菌盘，但这系列实验送了几次都收到短且不稳定的结
果，和该公司诸如「由於抽出质体浓度低，我们将再次培养後...」、「由於抽出质体
浓度低，我们将不再做...」之类的来信。实验室後来就决定这个质体将来都改用另一
家定序，根据经验定序结果比较长且稳定，但会要你自己制备并浓缩好DNA。
这种情况其实满常发生的；我们觉得接受菌的厂商可能也就是养出来用kit抽之後
直接定序，只要不是一楼说的那种好抽的质体就不会有太漂亮的结果。
※ 编辑: hermitwhite (1.168.83.14 台湾), 02/04/2020 14:16:26
11F：→ xxtomnyxx: 要说浓缩质体我会用的方法是酒精沈淀再用少量水回溶， 02/05 05:14
12F：→ xxtomnyxx: 倒是没试过低温乾燥 02/05 05:14
13F：→ MADAOTW: 沉淀前後的samples拿去跑胶,分子量一样吗？ 02/05 16:33
14F：→ hermitwhite: 分子量一样，且没有观察到明显的smear。 02/06 21:27
15F：推 Ianthegood: 有nanodrop的spectrum吗？有的话把kit跟pci抽的都丢上 02/07 07:19
16F：→ Ianthegood: 来大家看看 02/07 07:19
17F：→ hermitwhite: 中间还要继续定序，之後抽的时候我留一下。 02/07 21:18
18F：→ hitmd: mini kit或许可以换一家试试看? 02/07 23:34
19F：→ hitmd: 拍谢没有看到想探讨此现象的原因 02/07 23:49
20F：推 Alstonia: 好奇最後你有定序成功吗？你的plasmid有20k,是否有跟厂 02/10 22:31
21F：→ Alstonia: 商说？ 02/10 22:31
22F：推 Alstonia: 不建议你用乾燥的方式浓缩，抽出的的plasmid,多少都有盐 02/10 22:37
23F：→ Alstonia: 类跟蛋白残留，你用抽乾的方式会提高盐类浓度，不利後 02/10 22:37
24F：→ Alstonia: 序定序。 02/10 22:37
25F：推 Alstonia: 20k 的plasmid 你如果没先说，没换条件做，保证做不出 02/10 22:40
26F：→ Alstonia: 来的。 02/10 22:40
27F：→ hermitwhite: 累积多次定序有慢慢定出来了，就是浓缩很花时间，然 02/20 01:30
28F：→ hermitwhite: 後kit很贵。这些送定序样本的资讯我们都有给。 02/20 01:30
29F：→ hermitwhite: 现在这个定序单位对20k plasmid送定序建议的浓度是 02/20 01:32
30F：→ hermitwhite: 500ng/microliter，不浓缩也根本不知道怎麽生出来。 02/20 01:34
31F：→ hermitwhite: 虽然後来还是浓缩到200ng/microliter就送了。 02/20 01:35
※ 编辑: hermitwhite (125.230.16.105 台湾), 02/20/2020 02:29:25
32F：推 osla30: 是用Terrific Broth养吗？ 02/24 08:36
33F：→ hermitwhite: 好像是Miller's LB broth。 02/26 13:01
感谢大家的建议。我这阵子又做了一些测试，以下是後来确认的事：
1. 从DH5α和BW25113里萃取出的同一个质体都有此现象
2. 同系列其他质体没有发生相同现象，例如说我这个质体是pGETS118+A+B，而
pGETS118+A溶液浓缩不会产生沉淀，长度更长的pGETS118+A+C溶液浓缩也不
会产生沉淀；目前正在试着在後面接其他东西看看
然後以下是几个样本的Nanodrop spectrum，因为只是顺便纪录的所以参数
的对照性没很好。
样本1. Kit 回收，50 microliter
https://imgur.com/n3bLPnc
在乾浴槽中70℃烘乾20分钟後，产生少量白色沉淀
https://imgur.com/uYKFa9B
样本2. Kit 回收，50 microliter
https://imgur.com/8Ok4J35
在乾浴槽中70℃烘乾20分钟後，产生少量白色沉淀
https://imgur.com/77Ihd8M
样本3. Kit 回收，150 microliter
https://imgur.com/GNrlSFo
在减压浓缩机中60℃烘乾20分钟後，产生较大量白色沉淀
https://imgur.com/xeXmWWw
样本4. Kit 回收，150 microliter
https://imgur.com/WpRR6r9
在减压浓缩机中60℃烘乾20分钟後，产生较大量白色沉淀
https://imgur.com/F9Q9cIC
样本5. 传统法回收
已回溶後又减压浓缩了30分钟以上；未观察到沉淀
https://imgur.com/OSIEatG
※ 编辑: hermitwhite (1.168.75.50 台湾), 02/26/2020 13:26:51
34F：→ blence: 你给的260/280结果跟kit的比很糟,显示根本不适合传统回收 02/26 14:07
35F：→ blence: 你应该调整kit的使用,对於low copy,就使用平5~10x的菌量, 02/26 14:13
36F：→ blence: solution I~III也配合调整到2~3X的用量,以达到完全lyse 02/26 14:14
37F：→ blence: 而要纯化时,则是把上面放大的体积分次"只"过同一个column 02/26 14:23
38F：→ blence: 这样就算是low copy,也可以达到一般的浓度 02/26 14:26
39F：→ blence: 还有,对於你提到kit很贵这件事我也存疑,一个mini-prep再怎 02/26 14:31
40F：→ blence: 麽贵,也不会超过一个定序的价格,plasmid好好确认品质再送 02/26 14:34
这个质体的问题不只是low copy number，也包括了质体大回收率低。先前
我们使用midi kit一次抽70mL，单次回溶也最多能回收到60ng/microliter左右
（但前阵子厂商无法供应midi kit所以就改用mini），因此多次溶出或溶出较
大体积後浓缩可能是不可避免的。还是说大质体回收率低这件事能藉由让column
吸附到承载量上限来突破？
另外kit很贵是把一次会使用四到八个unit算进去，不过这是顺便一提，和
问题关系不大就是。
※ 编辑: hermitwhite (1.168.75.50 台湾), 02/26/2020 15:02:08
41F：→ blence: 既然你都知道是low copy了,怎麽会担心超过cloumn acpacity 02/26 17:08
42F：→ blence: 一般mini cloumng上限大约20ug,然後low copy plasmid每ml 02/26 17:21
43F：→ blence: 约1ug,所以用10ml以上的pellet去过同一个cloumn绰绰有余 02/26 17:24
44F：→ blence: 如果你是好几个column去回收再浓缩,结果自然会很糟 02/26 17:26
45F：→ hermitwhite: 我这里不是担心超过capacity，我是问说你是不是觉得 02/26 23:37
46F：→ hermitwhite: 吸附到接近capacity能增加溶出量；看起来是？ 02/26 23:38
47F：→ hermitwhite: 那理论上我换更薄的column来用也是一个办法？ 02/26 23:43
48F：→ blence: 当然不是！！ 02/27 00:04
49F：→ blence: low copy意味同体积的菌液可能只有平常1/10 plasmid 02/27 00:07
50F：→ blence: ->用平常的体积会导致只有1/10的浓度->浓度低,OD也极不准 02/27 00:07
51F：→ blence: ->但要是配合用1/10体积的水,则elute的效率会极差 02/27 00:10
52F：→ blence: 所以藉由增加plasmid input过cloumn的手段,才能兼顾效率 02/27 00:12
53F：→ blence: cloumn的厚薄跟capacity有关,量都不够了,用薄的不就更怪 02/27 00:14
54F：推 osla30: 要不要用Terrific Broth养看看？应该会长多一些 02/29 23:55
55F：→ hermitwhite: 感谢，之前不知道Terrific Broth的功能，最近才偶然 03/21 16:51
56F：→ hermitwhite: 看到能增加质体，之後有类似需求会试试看。还有这个 03/21 16:51
57F：→ hermitwhite: 质体现在我都PCR之後送产物去定序了，产量和定序的稳 03/21 16:53
58F：→ hermitwhite: 定性都明显有比较好。 03/21 16:54
※ 编辑: hermitwhite (36.234.7.166 台湾), 03/21/2020 16:54:46