作者zzxc87520 (珼珼)
看板Biotech
標題[求救] western 壓片疑惑
時間Tue Dec 10 18:36:52 2019
各位版大好
小的對於western blot可以說是非常之不擅長
在博班學長的帶領下data終於有稍稍好轉的跡象
但目前遇到不知該如何解決的問題
以下是實驗條件
Sample:
80ug 6xDye 煮6分鐘
-20保存
Running:
上膠 70v 30mins
下膠 120v 90mins 15%
Transfer:
濕式 300mA 90mins
PVDF 膜 100%甲醇 泡10mins以上
Transfer buffer(1:2:7=10xbuffer:甲醇：水）
Buffer會冰-20兩個小時(重複使用最多三次）
跑的時候有放冰保
跑的時候有放冰保
跑的時候有放冰保
Tank外有放冰塊保冷
Blocking:
5%脫脂牛奶 1小時 （TBST 洗3次，每次10分鐘）
1抗:
1抗:
4度c over night (抗體會重複使用）
（TBST 洗3次，每次10分鐘）
（TBST 洗3次，每次10分鐘）
2抗:
TBST 稀釋至 1:5000
室溫 1小時
（TBST 洗3次，每次10分鐘）
以下是實驗結果
https://i.imgur.com/g8oKfvP.jpg
https://i.imgur.com/c2tc9g4.jpg
圖片可以看到
圖片可以看到
在應該是蛋白的位置上有長長一條
不然就是像圖二的情形
我在壓Twist,snai1,slug的時候
常常有這種情況
不然就是全白沒有band
小的完全不知道該如何改善這件事情
請各位大大指點迷津
附上actin的data給各位參考一下
2抗稀釋至 1:10000
https://i.imgur.com/5TzimNi.jpg
--
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.217.230.109 (臺灣)
1F：→ xxtomnyxx: 上膠 0 V ????? 這是在跑身體健康的喔XDDDD12/10 18:46
阿哈哈哈哈為什麼我的7被消掉了，抱歉抱歉
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:48:19
2F：→ xxtomnyxx: 你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少12/10 18:48
3F：→ xxtomnyxx: 你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少12/10 18:48
4F：→ xxtomnyxx: 掉了一些重要的過程，是沒寫還是真的沒有？12/10 18:49
5F：→ xxtomnyxx: (如：PVDF先浸甲醇再拿來transfer)12/10 18:50
回x大，學長本人不跑western ，同學跟學妹的片子有問題大部分是背景髒或空白片，其他都是清晰的band。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:56:03
6F：→ xxtomnyxx: 然後我第一次看到有6x的SDS loading dye。還有二抗應該12/10 18:52
7F：→ xxtomnyxx: 也是要在牛奶裡吧怎麼會是TBST？不過這大概都不是主因12/10 18:53
8F：→ xxtomnyxx: ，你的問題比較像在transfer(包含)之前的問題12/10 18:53
回x大，2抗會在TBST裡是有老師建議，說是背景會比較乾淨，但小的覺得沒什麼差別，通常沒有data都是空白片，6xdye是學長給的配方，我們是自己配的，實驗室都是用這個跑的。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:05:23
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:06:49
9F：推 mokopo: 問一下 一抗有說要用BSA泡嗎？12/10 19:25
10F：推 Ianthegood: actin很美啊流程應該沒有問題 確定有表現嗎 不然就是12/10 19:54
11F：→ Ianthegood: 抗體需要特殊處理 要不要一抗番號來一下看有沒前輩有12/10 19:54
12F：→ Ianthegood: 經驗的12/10 19:54
13F：→ blence: 你把b-actin跑膠的條件membrane拿去染snail應該就好了12/10 20:55
回b大，我的actin跟snail是同一片膠，所以snail染成這樣我才覺得很疑惑。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 21:45:16
14F：推 qiet: 要不要改用bsa blocking & 配一抗試試，流程挺一般的沒啥問 12/10 23:37
15F：→ qiet: 題 12/10 23:37
16F：推 qiet: pvdf甲醇不用泡十分鐘吧，浸一下就好 12/10 23:41
17F：推 jsi: 推Ianthegood，beta-actin很美，跑膠應該沒問題，若抗體都有 12/11 01:05
18F：→ jsi: 照datasheet配置及反應，可能是target protein表現量低於偵測 12/11 01:05
19F：→ jsi: 極限，用recombinant protein或確定有表現的樣品做positive 12/11 01:05
20F：→ jsi: control就能確定了 12/11 01:05
21F：推 MADAOTW: 拿一抗說明書寫的比例與buf試試吧！現在還有實驗室在壓 12/11 11:41
22F：→ MADAOTW: 片？？ 12/11 11:41
23F：→ a90648: 我們所很多都還是用壓的阿 12/11 23:27
24F：推 joseph103331: Datasheet的常不準阿,不同廠商的膜也有差 12/12 00:33
25F：→ joseph103331: 背景霧狀表示二抗5000有點太高,訊號不好增加1抗看看 12/12 00:34
26F：推 agagy: 現在已經有不少便宜的掃描機器，足夠一般學術單位使用了 12/12 18:26
27F：→ lemonteas: transfer完，可以先染個ponceau S，確認transfer有做 12/13 10:56
28F：→ lemonteas: 成功。我跑transfer會穩壓75V，好像不是用穩流跑耶。如 12/13 10:56
29F：→ lemonteas: 果確定transfer有成功，可能是抗體的問題，抗體搖太久 12/13 10:56
30F：→ lemonteas: 或是抗體專一性不夠。 12/13 10:56
31F：推 Ianthegood: 底片的sensitivity是無法取代的 沒有人isotope用掃描 12/14 18:58
32F：→ Ianthegood: 機做的 12/14 18:58
33F：推 tynse71864: 掃描機用久很懷念洗片阿 12/14 20:26
34F：推 tynse71864: 另，原po的三隻抗體 (除了 actin) 都確定可以用嗎？ 12/14 20:29
35F：→ tynse71864: 有些抗體reuse效果也會變很差，是否這個原因造成的？ 12/14 20:31
36F：推 abcm1042: actin很漂亮步驟應該沒問題 感覺抗體不要重複用拿新的會 12/15 13:13
37F：→ abcm1042: 比較好嗎 或是蛋白純化過程是不是有問題？ 12/15 13:13
38F：→ abcm1042: 煮的時間可以拉長？ 12/15 13:15
39F：→ abcm1042: 或是samplebuf配方是？有sds膠當對照嗎 12/15 13:15
40F：推 Ianthegood: 或甚至不要煮熟 70-80度就好? 12/15 17:57
41F：→ ktirene: 我覺得twist本身就不是很好壓，我們實驗室換過多家抗體 12/16 00:48
42F：→ ktirene: 才找到一個堪用的~ 所以你要不要多試幾家抗體看看？ 12/16 00:48
43F：→ ktirene: btw 然後twist的1抗我會稍微配濃一點 12/16 00:49
44F：推 yaes111: 有沒有想過是抗體爛 12/18 20:20
45F：推 hsuaba: 有這個抗體的+ctrl嗎? 直覺是抗體不好 12/26 18:18
46F：推 walker456: actin看來沒什麼問題 抗體爛或是sample表達少的機率高 01/01 18:58
47F：推 xiphos: transfer沒成功會連actin都壓不好啦...... 02/01 06:46
48F：推 michealking: 把那三隻的抗體編號放上來吧...... 03/28 17:28