作者zzxc87520 (珼珼)
看板Biotech
标题[求救] western 压片疑惑
时间Tue Dec 10 18:36:52 2019
各位版大好
小的对於western blot可以说是非常之不擅长
在博班学长的带领下data终於有稍稍好转的迹象
但目前遇到不知该如何解决的问题
以下是实验条件
Sample:
80ug 6xDye 煮6分钟
-20保存
Running:
上胶 70v 30mins
下胶 120v 90mins 15%
Transfer:
湿式 300mA 90mins
PVDF 膜 100%甲醇 泡10mins以上
Transfer buffer(1:2:7=10xbuffer:甲醇：水）
Buffer会冰-20两个小时(重复使用最多三次）
跑的时候有放冰保
跑的时候有放冰保
跑的时候有放冰保
Tank外有放冰块保冷
Blocking:
5%脱脂牛奶 1小时 （TBST 洗3次，每次10分钟）
1抗:
1抗:
4度c over night (抗体会重复使用）
（TBST 洗3次，每次10分钟）
（TBST 洗3次，每次10分钟）
2抗:
TBST 稀释至 1:5000
室温 1小时
（TBST 洗3次，每次10分钟）
以下是实验结果
https://i.imgur.com/g8oKfvP.jpg
https://i.imgur.com/c2tc9g4.jpg
图片可以看到
图片可以看到
在应该是蛋白的位置上有长长一条
不然就是像图二的情形
我在压Twist,snai1,slug的时候
常常有这种情况
不然就是全白没有band
小的完全不知道该如何改善这件事情
请各位大大指点迷津
附上actin的data给各位参考一下
2抗稀释至 1:10000
https://i.imgur.com/5TzimNi.jpg
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.217.230.109 (台湾)
1F：→ xxtomnyxx: 上胶 0 V ????? 这是在跑身体健康的喔XDDDD12/10 18:46
阿哈哈哈哈为什麽我的7被消掉了，抱歉抱歉
※ 编辑: zzxc87520 (180.217.230.109 台湾), 12/10/2019 18:48:19
2F：→ xxtomnyxx: 你的学长做的western有这些问题吗？单看你的步骤其实少12/10 18:48
3F：→ xxtomnyxx: 你的学长做的western有这些问题吗？单看你的步骤其实少12/10 18:48
4F：→ xxtomnyxx: 掉了一些重要的过程，是没写还是真的没有？12/10 18:49
5F：→ xxtomnyxx: (如：PVDF先浸甲醇再拿来transfer)12/10 18:50
回x大，学长本人不跑western ，同学跟学妹的片子有问题大部分是背景脏或空白片，其他都是清晰的band。
※ 编辑: zzxc87520 (180.217.230.109 台湾), 12/10/2019 18:56:03
6F：→ xxtomnyxx: 然後我第一次看到有6x的SDS loading dye。还有二抗应该12/10 18:52
7F：→ xxtomnyxx: 也是要在牛奶里吧怎麽会是TBST？不过这大概都不是主因12/10 18:53
8F：→ xxtomnyxx: ，你的问题比较像在transfer(包含)之前的问题12/10 18:53
回x大，2抗会在TBST里是有老师建议，说是背景会比较乾净，但小的觉得没什麽差别，通常没有data都是空白片，6xdye是学长给的配方，我们是自己配的，实验室都是用这个跑的。
※ 编辑: zzxc87520 (180.217.230.109 台湾), 12/10/2019 19:05:23
※ 编辑: zzxc87520 (180.217.230.109 台湾), 12/10/2019 19:06:49
9F：推 mokopo: 问一下 一抗有说要用BSA泡吗？12/10 19:25
10F：推 Ianthegood: actin很美啊流程应该没有问题 确定有表现吗 不然就是12/10 19:54
11F：→ Ianthegood: 抗体需要特殊处理 要不要一抗番号来一下看有没前辈有12/10 19:54
12F：→ Ianthegood: 经验的12/10 19:54
13F：→ blence: 你把b-actin跑胶的条件membrane拿去染snail应该就好了12/10 20:55
回b大，我的actin跟snail是同一片胶，所以snail染成这样我才觉得很疑惑。
※ 编辑: zzxc87520 (180.217.230.109 台湾), 12/10/2019 21:45:16
14F：推 qiet: 要不要改用bsa blocking & 配一抗试试，流程挺一般的没啥问 12/10 23:37
15F：→ qiet: 题 12/10 23:37
16F：推 qiet: pvdf甲醇不用泡十分钟吧，浸一下就好 12/10 23:41
17F：推 jsi: 推Ianthegood，beta-actin很美，跑胶应该没问题，若抗体都有 12/11 01:05
18F：→ jsi: 照datasheet配置及反应，可能是target protein表现量低於侦测 12/11 01:05
19F：→ jsi: 极限，用recombinant protein或确定有表现的样品做positive 12/11 01:05
20F：→ jsi: control就能确定了 12/11 01:05
21F：推 MADAOTW: 拿一抗说明书写的比例与buf试试吧！现在还有实验室在压 12/11 11:41
22F：→ MADAOTW: 片？？ 12/11 11:41
23F：→ a90648: 我们所很多都还是用压的阿 12/11 23:27
24F：推 joseph103331: Datasheet的常不准阿,不同厂商的膜也有差 12/12 00:33
25F：→ joseph103331: 背景雾状表示二抗5000有点太高,讯号不好增加1抗看看 12/12 00:34
26F：推 agagy: 现在已经有不少便宜的扫描机器，足够一般学术单位使用了 12/12 18:26
27F：→ lemonteas: transfer完，可以先染个ponceau S，确认transfer有做 12/13 10:56
28F：→ lemonteas: 成功。我跑transfer会稳压75V，好像不是用稳流跑耶。如 12/13 10:56
29F：→ lemonteas: 果确定transfer有成功，可能是抗体的问题，抗体摇太久 12/13 10:56
30F：→ lemonteas: 或是抗体专一性不够。 12/13 10:56
31F：推 Ianthegood: 底片的sensitivity是无法取代的 没有人isotope用扫描 12/14 18:58
32F：→ Ianthegood: 机做的 12/14 18:58
33F：推 tynse71864: 扫描机用久很怀念洗片阿 12/14 20:26
34F：推 tynse71864: 另，原po的三只抗体 (除了 actin) 都确定可以用吗？ 12/14 20:29
35F：→ tynse71864: 有些抗体reuse效果也会变很差，是否这个原因造成的？ 12/14 20:31
36F：推 abcm1042: actin很漂亮步骤应该没问题 感觉抗体不要重复用拿新的会 12/15 13:13
37F：→ abcm1042: 比较好吗 或是蛋白纯化过程是不是有问题？ 12/15 13:13
38F：→ abcm1042: 煮的时间可以拉长？ 12/15 13:15
39F：→ abcm1042: 或是samplebuf配方是？有sds胶当对照吗 12/15 13:15
40F：推 Ianthegood: 或甚至不要煮熟 70-80度就好? 12/15 17:57
41F：→ ktirene: 我觉得twist本身就不是很好压，我们实验室换过多家抗体 12/16 00:48
42F：→ ktirene: 才找到一个堪用的~ 所以你要不要多试几家抗体看看？ 12/16 00:48
43F：→ ktirene: btw 然後twist的1抗我会稍微配浓一点 12/16 00:49
44F：推 yaes111: 有没有想过是抗体烂 12/18 20:20
45F：推 hsuaba: 有这个抗体的+ctrl吗? 直觉是抗体不好 12/26 18:18
46F：推 walker456: actin看来没什麽问题 抗体烂或是sample表达少的机率高 01/01 18:58
47F：推 xiphos: transfer没成功会连actin都压不好啦...... 02/01 06:46
48F：推 michealking: 把那三只的抗体编号放上来吧...... 03/28 17:28