作者MLSHBen (酷喔)
看板Biotech
標題[求救] Primary culture
時間Wed Nov 20 20:16:14 2019
大家好
最近老師要我從合作醫生那邊取得的抽脂液 (liposuction)分離脂肪幹細胞
之前沒做過primary cell culture，所以有一些問題想請教一下板上的大大們
先列一下我的步驟 (參考一些paper後整理出來)：
1. 抽脂液放冰上送往實驗室
2. 倒至50 ml離心管至20~25 ml左右高度，加入HBSS至50 ml，搖晃以wash
3. 離心：500 G 10分鐘
4. 以pipet將脂肪組織下的HBSS完全吸掉
5. 重複2.~4.以HBSS再wash一次
(若還有紅色液體 (可能是血液之類的)殘留則再繼續wash，避免影響collagenase作用)
6. 加入collagenase type I (量至少蓋過離心下來的脂肪組織)
(2 mg/ml in HBSS, 300 U/mg, 0.22-um low protein binding filtered)
7. 37度水浴30~60分鐘，每5~10分鐘invert 5次
8. 加入等體積培養液 (alpha-MEM with 10% FBS, 1% PS)以中和collagenase
9. 離心：600 G 10分鐘，倒掉上清液
10. 加入10 ml ACK lysing buffer至pellet，室溫靜置5分鐘以溶掉紅血球
11. 離心：300 G 5分鐘，倒掉上清液
12. 以1 ml培養液回溶pellet，加入適當體積培養液後混勻，過40-um細胞過濾器
13. 加至適當dish或flask
14. 隔天將懸浮細胞吸掉，以PBS wash後換新培養液
步驟大概如上
想問的是
1. 檢體的運送
查過網路上的primary cell culture的經驗分享
大多是建議現採現做，但由於醫院和實驗室有約1小時車程的距離
所以打算讓它保存在4度的狀態運回實驗室
(以前實驗室學姐有教離心管內的細胞如果暫時沒做實驗可以放冰上，但好像不能放太久...)
但回去可能很晚無法做實驗了
有看到說法是可以放4度24~72小時，不知道正不正確...
所以想請教一下運送和保存的條件是否可以放4度？ (可以的話我不會讓其超過24小時)
有經驗是不建議凍存 (-20或-80度)，理由是產生的冰晶會破壞細胞
2. collagenase type I的濃度
看過有的paper是寫0.075%，有的是寫2 mg/ml
但具體作用好像是看digestion unit
但大家paper都沒寫，而每次廠商出貨的品質也不盡相同
(每批貨的digestion unit不會一樣)
想請問我這濃度是否OK？
3. 離心轉速
看過有的paper寫是用300 G，有的是用600 G
以前離心細胞都是用400 G (跟300 G差100 rpm)
不知道離心用600 G是否OK？
大概是這幾個問題想請教板上的大大
先謝謝大家了
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1F：推 tynse71864: 1. 別吧； 之前收 peripheral Φ， 把沒做完的細胞丟 11/23 12:34
2F：→ tynse71864: 在 50ml 放冰箱, 隔天全部黏在管底…… 11/23 12:34
3F：推 tynse71864: 運送插冰上可以，但我回實驗室就立刻種細胞了 11/23 12:39
4F：→ turtle24: 人類檢體盡量能當天弄完就好 11/23 14:05
謝謝您們的建議
※ 編輯: MLSHBen (1.160.112.51 臺灣), 11/23/2019 15:33:13
5F：推 tynse71864: 3. 若300g 下的來就用 300即可，除非他 pellet看起來 11/24 12:57
6F：→ tynse71864: 就是下不太來 11/24 12:57