作者MLSHBen (酷喔)
看板Biotech
标题[求救] Primary culture
时间Wed Nov 20 20:16:14 2019
大家好
最近老师要我从合作医生那边取得的抽脂液 (liposuction)分离脂肪干细胞
之前没做过primary cell culture，所以有一些问题想请教一下板上的大大们
先列一下我的步骤 (参考一些paper後整理出来)：
1. 抽脂液放冰上送往实验室
2. 倒至50 ml离心管至20~25 ml左右高度，加入HBSS至50 ml，摇晃以wash
3. 离心：500 G 10分钟
4. 以pipet将脂肪组织下的HBSS完全吸掉
5. 重复2.~4.以HBSS再wash一次
(若还有红色液体 (可能是血液之类的)残留则再继续wash，避免影响collagenase作用)
6. 加入collagenase type I (量至少盖过离心下来的脂肪组织)
(2 mg/ml in HBSS, 300 U/mg, 0.22-um low protein binding filtered)
7. 37度水浴30~60分钟，每5~10分钟invert 5次
8. 加入等体积培养液 (alpha-MEM with 10% FBS, 1% PS)以中和collagenase
9. 离心：600 G 10分钟，倒掉上清液
10. 加入10 ml ACK lysing buffer至pellet，室温静置5分钟以溶掉红血球
11. 离心：300 G 5分钟，倒掉上清液
12. 以1 ml培养液回溶pellet，加入适当体积培养液後混匀，过40-um细胞过滤器
13. 加至适当dish或flask
14. 隔天将悬浮细胞吸掉，以PBS wash後换新培养液
步骤大概如上
想问的是
1. 检体的运送
查过网路上的primary cell culture的经验分享
大多是建议现采现做，但由於医院和实验室有约1小时车程的距离
所以打算让它保存在4度的状态运回实验室
(以前实验室学姐有教离心管内的细胞如果暂时没做实验可以放冰上，但好像不能放太久...)
但回去可能很晚无法做实验了
有看到说法是可以放4度24~72小时，不知道正不正确...
所以想请教一下运送和保存的条件是否可以放4度？ (可以的话我不会让其超过24小时)
有经验是不建议冻存 (-20或-80度)，理由是产生的冰晶会破坏细胞
2. collagenase type I的浓度
看过有的paper是写0.075%，有的是写2 mg/ml
但具体作用好像是看digestion unit
但大家paper都没写，而每次厂商出货的品质也不尽相同
(每批货的digestion unit不会一样)
想请问我这浓度是否OK？
3. 离心转速
看过有的paper写是用300 G，有的是用600 G
以前离心细胞都是用400 G (跟300 G差100 rpm)
不知道离心用600 G是否OK？
大概是这几个问题想请教板上的大大
先谢谢大家了
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※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1574252176.A.B32.html
1F：推 tynse71864: 1. 别吧； 之前收 peripheral Φ， 把没做完的细胞丢 11/23 12:34
2F：→ tynse71864: 在 50ml 放冰箱, 隔天全部黏在管底…… 11/23 12:34
3F：推 tynse71864: 运送插冰上可以，但我回实验室就立刻种细胞了 11/23 12:39
4F：→ turtle24: 人类检体尽量能当天弄完就好 11/23 14:05
谢谢您们的建议
※ 编辑: MLSHBen (1.160.112.51 台湾), 11/23/2019 15:33:13
5F：推 tynse71864: 3. 若300g 下的来就用 300即可，除非他 pellet看起来 11/24 12:57
6F：→ tynse71864: 就是下不太来 11/24 12:57