作者belle0625070 (貝拉)
看板Biotech
標題[求救] EMSA 跑完只看到很淡的free probe
時間Fri Nov 15 05:28:39 2019
大家好，以下是我的實驗設置：
Probe 是從一般PCR primer 開始，分別forward和reverse (36bp)，使用3’end DNA labeling kit，最後等量混合兩者，用PCR儀從90度等梯度降溫30分鐘，室溫靜置一小時後分裝，-20度保存。
核蛋白是從90%細胞匯集度100mm dish上用nuclear extract kit收集的，按說明書操作最後分裝-80度保存。
以下是我每一孔的配置，最後三孔是按照廠商給的說明書配的。
https://i.imgur.com/il7bnSR.jpg
(WT: wild type/ MT: mutant)
我的實驗結果如下：
https://i.imgur.com/RQNQLI0.jpg
（曝光時間30sec vs 3sec)
最右邊三孔是照廠商給的說明書按表操課完全沒問題，但是左邊我自己做到的部分我不知道那邊可能弄錯了，只看到很淡的free probe。
探針濃度應該已經超級高了，probe final con. 5nM，廠商給的建議終濃度只需要20fM。
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1F：→ blence: anneal從90度?? 11/15 12:32
2F：→ belle0625070: 按照說明書從90度1分鐘後等梯度降溫到Primer art 對 11/15 14:18
3F：→ belle0625070: 應的annealing temperature （我的是61度）剛好約30 11/15 14:18
4F：→ belle0625070: 分鐘 11/15 14:18
5F：→ belle0625070: *primer set 11/15 14:19
6F：→ blence: 想知道哪一家的kit,因為thermo的EMSA kit跟RNAi core的都 11/15 15:13
7F：→ blence: 不是從90度做起,incubate時間也不對 11/15 15:13
8F：→ blence: 另方面如果是biotin,你也可以直接合label好的,不用自己接 11/15 15:25
9F：→ belle0625070: 是Thermo的Kit，＃89818 11/16 04:34
11F：→ Ianthegood: 照片解析度很糟耶 根本看不到你的treatment 11/16 07:58
12F：→ skyken10: 有先把probe進行clean，測試label 的效率嗎？ 11/17 12:32
13F：推 skyken10: 你的確有加這麼多DNA，只是沒有這麼多被label的DNA被你 11/17 12:34
14F：→ skyken10: 看見唷 11/17 12:34
15F：推 skyken10: 在後續EMSA的實驗，沒被label到的probe也會去競爭你的蛋 11/17 12:37
16F：→ skyken10: 白質，造成你要使用更多的蛋白質，所以希望label效率越 11/17 12:37
17F：→ skyken10: 高越好，才能真正反應出目標蛋白對於此序列的親和力 11/17 12:37
18F：推 Ianthegood: nuclear protein拿麼多 確定不是3’被吃掉了? 11/18 21:17