作者belle0625070 (贝拉)
看板Biotech
标题[求救] EMSA 跑完只看到很淡的free probe
时间Fri Nov 15 05:28:39 2019
大家好，以下是我的实验设置：
Probe 是从一般PCR primer 开始，分别forward和reverse (36bp)，使用3’end DNA labeling kit，最後等量混合两者，用PCR仪从90度等梯度降温30分钟，室温静置一小时後分装，-20度保存。
核蛋白是从90%细胞汇集度100mm dish上用nuclear extract kit收集的，按说明书操作最後分装-80度保存。
以下是我每一孔的配置，最後三孔是按照厂商给的说明书配的。
https://i.imgur.com/il7bnSR.jpg
(WT: wild type/ MT: mutant)
我的实验结果如下：
https://i.imgur.com/RQNQLI0.jpg
（曝光时间30sec vs 3sec)
最右边三孔是照厂商给的说明书按表操课完全没问题，但是左边我自己做到的部分我不知道那边可能弄错了，只看到很淡的free probe。
探针浓度应该已经超级高了，probe final con. 5nM，厂商给的建议终浓度只需要20fM。
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1F：→ blence: anneal从90度?? 11/15 12:32
2F：→ belle0625070: 按照说明书从90度1分钟後等梯度降温到Primer art 对 11/15 14:18
3F：→ belle0625070: 应的annealing temperature （我的是61度）刚好约30 11/15 14:18
4F：→ belle0625070: 分钟 11/15 14:18
5F：→ belle0625070: *primer set 11/15 14:19
6F：→ blence: 想知道哪一家的kit,因为thermo的EMSA kit跟RNAi core的都 11/15 15:13
7F：→ blence: 不是从90度做起,incubate时间也不对 11/15 15:13
8F：→ blence: 另方面如果是biotin,你也可以直接合label好的,不用自己接 11/15 15:25
9F：→ belle0625070: 是Thermo的Kit，＃89818 11/16 04:34
11F：→ Ianthegood: 照片解析度很糟耶 根本看不到你的treatment 11/16 07:58
12F：→ skyken10: 有先把probe进行clean，测试label 的效率吗？ 11/17 12:32
13F：推 skyken10: 你的确有加这麽多DNA，只是没有这麽多被label的DNA被你 11/17 12:34
14F：→ skyken10: 看见唷 11/17 12:34
15F：推 skyken10: 在後续EMSA的实验，没被label到的probe也会去竞争你的蛋 11/17 12:37
16F：→ skyken10: 白质，造成你要使用更多的蛋白质，所以希望label效率越 11/17 12:37
17F：→ skyken10: 高越好，才能真正反应出目标蛋白对於此序列的亲和力 11/17 12:37
18F：推 Ianthegood: nuclear protein拿麽多 确定不是3’被吃掉了? 11/18 21:17