作者markzine101 (米克)
看板Biotech
標題[求救] ligation 片段不對
時間Wed Oct 30 01:53:17 2019
我們實驗室用TOPO TA cloning kit包括勝任細胞也用買的.
Vector 用PCR2.1vector ，長度大約3.5k
Insert 為PCR產物切膠純化，大約1719bp，純化後的產物再跑膠確認一次。另外有經過sequencing確認頭尾兩端在正確的位置，不過定序結果訊號很弱也沒重做。
按照protocol做ligation和heat shock transform後塗盤，挑6顆白色菌落抽plasmid。之後用cloning primer 做PCR檢察，結果4顆空包彈，另外兩顆有band,不過長度只有400bp。
之後將cloning primer 拆開來分別和我診斷用的primer搭配再跑pcr檢察看看
1.
Cloning primer forward+diagnostic primer reverse
產物預計450bp
2.
Diagnostic primer forward+cloning primer reverse
產物預計350bp
結果只有1有產物
想知道有哪些原因造成這樣的結果，還是再多挑幾個菌落看看就中獎了？
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1F：→ e104582001: 把vector 用酵素切1刀後對大小，多切幾刀也可以 10/30 13:44
2F：→ e104582001: 感覺像是菌體遇到特定片段修飾了植體 10/30 13:45
3F：推 leon00521: cloning基本上花時間trouble shooting不如多做幾次吧 10/30 17:30
4F：→ xxtomnyxx: 1. 你的 Insert 多大？ 2. 空包彈是指玩全沒有PCR產 10/30 19:15
5F：→ xxtomnyxx: 物嗎？ 10/30 19:16
6F：→ xxtomnyxx: Cloning primer 是你用來放大 insert 的 primer 還是指 10/30 19:18
7F：→ xxtomnyxx: pCR2.1 上面用來 screening 的 primer？ 10/30 19:19
8F：→ Ianthegood: 我個人是colony pcr都跑24顆的倍數啦 給你參考 10/30 21:38
9F：→ ganbaba: PCR產物可以試試clean up後直接ligate，不要跑膠純化 10/31 12:20
10F：→ blence: PCR完不跑膠就做clean up,怎麼知道有產物？ 10/31 19:42
11F：推 osla30: insert用什麼DNA polymerase去P的？ 10/31 19:43
12F：→ blence: 如果跑完膠再做clean up,何不直接把那塊膠切下來純化 10/31 19:43
13F：推 osla30: 我想樓上只是想增加產量，跑膠取個一滴滴就好，其他拿去cl 10/31 19:55
14F：→ osla30: ean up，回收產量比切膠來的多 10/31 19:55
15F：→ blence: clean up好一點有95%,跑膠回收量應該也有80~90%,我是不相 10/31 20:00
16F：→ blence: 信兩種會差多少啦,何況clean up還要浪費那一滴滴 10/31 20:00
17F：推 osla30: 或許我們用的kit不好吧，我兩種回收率差不少XD 10/31 20:09
18F：→ osla30: 其實seamless cloning已經很成熟了，但還是看到大家普遍在 10/31 20:13
19F：→ osla30: 用這些傳統方法，實在覺得有點沒效率 10/31 20:13
20F：→ xxtomnyxx: 因為$$$啊..... 10/31 23:23
21F：→ xxtomnyxx: 我實驗室用的 PCR clean up/Gel extraction Kit 會有差 10/31 23:24
22F：→ xxtomnyxx: ，但是可以差很多也可以差很少，然後我覺得 column 放 10/31 23:24
23F：→ xxtomnyxx: 久了回收率都會變差，可能有氧化變質的問題吧... 10/31 23:25
24F：→ osla30: $其實不是啥問題，反而比傳統法省時省錢，以Gibson overla 10/31 23:55
25F：→ osla30: p方式設計primer去p insert，cotransform insert & vector 10/31 23:55
26F：→ osla30: ，剩下的事，E.coli都會幫你完成 10/31 23:55
27F：→ blence: 序列拿出來要仰賴PCR,每次都要送定序檢查,不愛用 11/01 00:13
28F：推 rsggsr: gel extraction通常不會到八九成吧 大多三四成 11/01 00:21
29F：→ blence: 那是因為許多人為了用濃的insert做ligation,elute體積少到 11/01 00:39
30F：→ blence: 誇張,Qiagen Gel Extraction manual就有這樣的data 11/01 00:39
31F：→ blence: 就連台廠genemark,geneaid這些也都有80%的水準了 11/01 00:43
32F：→ osla30: overlap放進MCS後，定序一次確認ok後，未來愛怎麼搬就怎 11/01 00:51
33F：→ osla30: 麼搬，不用再定序呀，且一般發問都是接不進去的，放不進去 11/01 00:51
34F：→ osla30: 後面也不用談定序了 11/01 00:51
35F：→ osla30: 自己是蠻愛用的啦XDD 11/01 00:52
36F：→ ganbaba: 其實也不全是產量多的關係，有時候就是跑膠純化接不起來 11/01 08:48
37F：→ ganbaba: ，pcr clean up就可以，推測是跑膠後a tail不見了@@ 11/01 08:48
38F：→ ganbaba: 而且TA說真的不需要跑膠純化，多浪費時間而已 11/01 08:50
39F：推 hitmd: 有很多好用的 kit ，如果$$不是問題的話 11/01 21:05
40F：推 Ice9: 除非很確定 PCR產物很純，不然直接 clean up拿去接會很慘。 11/02 10:58
41F：→ Ice9: 建議還是要切膠。 11/02 10:58
42F：推 misssquid: 這個我做過，切膠回收會比較好，但還是有小片段(跑PCR 01/16 21:22
43F：→ misssquid: 是看不到的)；ligation的時候小片段就是比較容易接上， 01/16 21:22
44F：→ misssquid: 用力用colony pcr挑吧 01/16 21:22