作者markzine101 (米克)
看板Biotech
标题[求救] ligation 片段不对
时间Wed Oct 30 01:53:17 2019
我们实验室用TOPO TA cloning kit包括胜任细胞也用买的.
Vector 用PCR2.1vector ，长度大约3.5k
Insert 为PCR产物切胶纯化，大约1719bp，纯化後的产物再跑胶确认一次。另外有经过sequencing确认头尾两端在正确的位置，不过定序结果讯号很弱也没重做。
按照protocol做ligation和heat shock transform後涂盘，挑6颗白色菌落抽plasmid。之後用cloning primer 做PCR检察，结果4颗空包弹，另外两颗有band,不过长度只有400bp。
之後将cloning primer 拆开来分别和我诊断用的primer搭配再跑pcr检察看看
1.
Cloning primer forward+diagnostic primer reverse
产物预计450bp
2.
Diagnostic primer forward+cloning primer reverse
产物预计350bp
结果只有1有产物
想知道有哪些原因造成这样的结果，还是再多挑几个菌落看看就中奖了？
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1F：→ e104582001: 把vector 用酵素切1刀後对大小，多切几刀也可以 10/30 13:44
2F：→ e104582001: 感觉像是菌体遇到特定片段修饰了植体 10/30 13:45
3F：推 leon00521: cloning基本上花时间trouble shooting不如多做几次吧 10/30 17:30
4F：→ xxtomnyxx: 1. 你的 Insert 多大？ 2. 空包弹是指玩全没有PCR产 10/30 19:15
5F：→ xxtomnyxx: 物吗？ 10/30 19:16
6F：→ xxtomnyxx: Cloning primer 是你用来放大 insert 的 primer 还是指 10/30 19:18
7F：→ xxtomnyxx: pCR2.1 上面用来 screening 的 primer？ 10/30 19:19
8F：→ Ianthegood: 我个人是colony pcr都跑24颗的倍数啦 给你参考 10/30 21:38
9F：→ ganbaba: PCR产物可以试试clean up後直接ligate，不要跑胶纯化 10/31 12:20
10F：→ blence: PCR完不跑胶就做clean up,怎麽知道有产物？ 10/31 19:42
11F：推 osla30: insert用什麽DNA polymerase去P的？ 10/31 19:43
12F：→ blence: 如果跑完胶再做clean up,何不直接把那块胶切下来纯化 10/31 19:43
13F：推 osla30: 我想楼上只是想增加产量，跑胶取个一滴滴就好，其他拿去cl 10/31 19:55
14F：→ osla30: ean up，回收产量比切胶来的多 10/31 19:55
15F：→ blence: clean up好一点有95%,跑胶回收量应该也有80~90%,我是不相 10/31 20:00
16F：→ blence: 信两种会差多少啦,何况clean up还要浪费那一滴滴 10/31 20:00
17F：推 osla30: 或许我们用的kit不好吧，我两种回收率差不少XD 10/31 20:09
18F：→ osla30: 其实seamless cloning已经很成熟了，但还是看到大家普遍在 10/31 20:13
19F：→ osla30: 用这些传统方法，实在觉得有点没效率 10/31 20:13
20F：→ xxtomnyxx: 因为$$$啊..... 10/31 23:23
21F：→ xxtomnyxx: 我实验室用的 PCR clean up/Gel extraction Kit 会有差 10/31 23:24
22F：→ xxtomnyxx: ，但是可以差很多也可以差很少，然後我觉得 column 放 10/31 23:24
23F：→ xxtomnyxx: 久了回收率都会变差，可能有氧化变质的问题吧... 10/31 23:25
24F：→ osla30: $其实不是啥问题，反而比传统法省时省钱，以Gibson overla 10/31 23:55
25F：→ osla30: p方式设计primer去p insert，cotransform insert & vector 10/31 23:55
26F：→ osla30: ，剩下的事，E.coli都会帮你完成 10/31 23:55
27F：→ blence: 序列拿出来要仰赖PCR,每次都要送定序检查,不爱用 11/01 00:13
28F：推 rsggsr: gel extraction通常不会到八九成吧 大多三四成 11/01 00:21
29F：→ blence: 那是因为许多人为了用浓的insert做ligation,elute体积少到 11/01 00:39
30F：→ blence: 夸张,Qiagen Gel Extraction manual就有这样的data 11/01 00:39
31F：→ blence: 就连台厂genemark,geneaid这些也都有80%的水准了 11/01 00:43
32F：→ osla30: overlap放进MCS後，定序一次确认ok後，未来爱怎麽搬就怎 11/01 00:51
33F：→ osla30: 麽搬，不用再定序呀，且一般发问都是接不进去的，放不进去 11/01 00:51
34F：→ osla30: 後面也不用谈定序了 11/01 00:51
35F：→ osla30: 自己是蛮爱用的啦XDD 11/01 00:52
36F：→ ganbaba: 其实也不全是产量多的关系，有时候就是跑胶纯化接不起来 11/01 08:48
37F：→ ganbaba: ，pcr clean up就可以，推测是跑胶後a tail不见了@@ 11/01 08:48
38F：→ ganbaba: 而且TA说真的不需要跑胶纯化，多浪费时间而已 11/01 08:50
39F：推 hitmd: 有很多好用的 kit ，如果$$不是问题的话 11/01 21:05
40F：推 Ice9: 除非很确定 PCR产物很纯，不然直接 clean up拿去接会很惨。 11/02 10:58
41F：→ Ice9: 建议还是要切胶。 11/02 10:58
42F：推 misssquid: 这个我做过，切胶回收会比较好，但还是有小片段(跑PCR 01/16 21:22
43F：→ misssquid: 是看不到的)；ligation的时候小片段就是比较容易接上， 01/16 21:22
44F：→ misssquid: 用力用colony pcr挑吧 01/16 21:22