作者yayayoyi (drip brew)
看板Biotech
標題[求救] Recombinant protein不表現了
時間Sun Apr 28 23:49:34 2019
求救
我用E. coli overexpress recombinant protein
已穩妥使用1年吧
突然不表現了
從凍菌管重挖的也一樣
怎辦~~~~~
我有從他的前身DH5a重抽plasmid transform到相同的表現的菌
還是無法...
其實都有表現
但量極低，純化出來只有一點點
有什麼原因或辦法嗎…
極度懊惱怎麼最重要的只有凍一管
明明其他都凍2管以上...
求救
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1F：推 maurice9325: 你有沒有檢查IPTG有沒有壞，會不會是沒有被induce? 04/29 01:43
2F：推 july81212: Pellet 檢查一下 可能掉去inclusion body 04/29 09:22
3F：推 joseph103331: 樓上兩個都超有可能XD 04/29 14:33
4F：推 Ianthegood: 或甚至是兩個綜合 上一管iptg掛了所以你一直都用比較 04/29 21:39
5F：→ Ianthegood: 低的濃度在induce 新一管濃度對了就把蛋白全部推到ib 04/29 21:39
6F：→ Ianthegood: 裡面XD 04/29 21:39
7F：推 huuban: I大這描述XDD 04/29 23:59
8F：推 joseph103331: 我覺得這個論述很可以 很真實XD 04/30 11:28
9F：→ Ianthegood: 自己養屎汁也養好一陣子了該碰到的都碰過了XD 04/30 19:30
10F：→ yayayoyi: 我有positive control，IPTG沒問題，也沒在pellet裡面.. 04/30 23:33
11F：→ yayayoyi: . 還有什麼可能嗎… 04/30 23:33
12F：→ Ianthegood: 表現太好啊 降低iptg試看看 04/30 23:37
13F：→ yayayoyi: 之前都是用固定的濃度呀…，好哦明天做一波篩看看濃度.. 04/30 23:41
14F：→ yayayoyi: . 04/30 23:41
15F：→ GG810424: 先檢查有無表現，再看是在pellet還是supernant，有表現 05/01 01:23
16F：→ GG810424: 表示IPTG無問題。 05/01 01:23
17F：→ GG810424: 降低induction 濃度至0.2mM IPTG 05/01 01:24
18F：→ GG810424: 時間調整至16度C 14-16小時 05/01 01:24
19F：→ GG810424: 破菌盡量用French pressure 05/01 01:25
20F：→ GG810424: 基本上只要有表現，後續各種purify 方法都能得到蛋白， 05/01 01:27
21F：→ GG810424: 像是用Urea 破inclusion body，先Denature 再refolding 05/01 01:27
22F：推 GG810424: IPTG: 0.2*238.31*0.01=0.476g 05/01 01:30
23F：→ GG810424: 溶在10ml ddH2O,過0.22 micrometer filter 05/01 01:31
24F：→ GG810424: Stock 0.2M , working 1000倍稀釋成0.2mM 05/01 01:32
25F：→ GG810424: 若這樣做還有問題歡迎站內信洽詢，能幫的都會盡量幫。 05/01 01:33
26F：→ GG810424: 記得要Re-transform 到BL-21 (DE3) ;DH5a是用來萃取plas 05/01 01:36
27F：→ GG810424: mid DNA不能表現蛋白質 05/01 01:36
28F：→ GG810424: 還有解凍的菌液很容易跑到inclusion body 05/01 01:37
29F：→ GG810424: 盡量每次要純化蛋白都要重新re-transformation 05/01 01:38
30F：→ GG810424: 要把純化蛋白的過程，做的像製程一樣穩定。每一個環節 05/01 01:39
31F：→ GG810424: 都趨近於100%一樣。 05/01 01:39
32F：→ GG810424: 這樣純化出來的蛋白，不同的Batch才會Quality control 05/01 01:40
33F：→ GG810424: 很穩定。 05/01 01:40
34F：→ jinshiG: 重新晝菌了啦！ 06/14 08:17