作者yayayoyi (drip brew)
看板Biotech
标题[求救] Recombinant protein不表现了
时间Sun Apr 28 23:49:34 2019
求救
我用E. coli overexpress recombinant protein
已稳妥使用1年吧
突然不表现了
从冻菌管重挖的也一样
怎办~~~~~
我有从他的前身DH5a重抽plasmid transform到相同的表现的菌
还是无法...
其实都有表现
但量极低，纯化出来只有一点点
有什麽原因或办法吗…
极度懊恼怎麽最重要的只有冻一管
明明其他都冻2管以上...
求救
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1F：推 maurice9325: 你有没有检查IPTG有没有坏，会不会是没有被induce? 04/29 01:43
2F：推 july81212: Pellet 检查一下 可能掉去inclusion body 04/29 09:22
3F：推 joseph103331: 楼上两个都超有可能XD 04/29 14:33
4F：推 Ianthegood: 或甚至是两个综合 上一管iptg挂了所以你一直都用比较 04/29 21:39
5F：→ Ianthegood: 低的浓度在induce 新一管浓度对了就把蛋白全部推到ib 04/29 21:39
6F：→ Ianthegood: 里面XD 04/29 21:39
7F：推 huuban: I大这描述XDD 04/29 23:59
8F：推 joseph103331: 我觉得这个论述很可以 很真实XD 04/30 11:28
9F：→ Ianthegood: 自己养屎汁也养好一阵子了该碰到的都碰过了XD 04/30 19:30
10F：→ yayayoyi: 我有positive control，IPTG没问题，也没在pellet里面.. 04/30 23:33
11F：→ yayayoyi: . 还有什麽可能吗… 04/30 23:33
12F：→ Ianthegood: 表现太好啊 降低iptg试看看 04/30 23:37
13F：→ yayayoyi: 之前都是用固定的浓度呀…，好哦明天做一波筛看看浓度.. 04/30 23:41
14F：→ yayayoyi: . 04/30 23:41
15F：→ GG810424: 先检查有无表现，再看是在pellet还是supernant，有表现 05/01 01:23
16F：→ GG810424: 表示IPTG无问题。 05/01 01:23
17F：→ GG810424: 降低induction 浓度至0.2mM IPTG 05/01 01:24
18F：→ GG810424: 时间调整至16度C 14-16小时 05/01 01:24
19F：→ GG810424: 破菌尽量用French pressure 05/01 01:25
20F：→ GG810424: 基本上只要有表现，後续各种purify 方法都能得到蛋白， 05/01 01:27
21F：→ GG810424: 像是用Urea 破inclusion body，先Denature 再refolding 05/01 01:27
22F：推 GG810424: IPTG: 0.2*238.31*0.01=0.476g 05/01 01:30
23F：→ GG810424: 溶在10ml ddH2O,过0.22 micrometer filter 05/01 01:31
24F：→ GG810424: Stock 0.2M , working 1000倍稀释成0.2mM 05/01 01:32
25F：→ GG810424: 若这样做还有问题欢迎站内信洽询，能帮的都会尽量帮。 05/01 01:33
26F：→ GG810424: 记得要Re-transform 到BL-21 (DE3) ;DH5a是用来萃取plas 05/01 01:36
27F：→ GG810424: mid DNA不能表现蛋白质 05/01 01:36
28F：→ GG810424: 还有解冻的菌液很容易跑到inclusion body 05/01 01:37
29F：→ GG810424: 尽量每次要纯化蛋白都要重新re-transformation 05/01 01:38
30F：→ GG810424: 要把纯化蛋白的过程，做的像制程一样稳定。每一个环节 05/01 01:39
31F：→ GG810424: 都趋近於100%一样。 05/01 01:39
32F：→ GG810424: 这样纯化出来的蛋白，不同的Batch才会Quality control 05/01 01:40
33F：→ GG810424: 很稳定。 05/01 01:40
34F：→ jinshiG: 重新昼菌了啦！ 06/14 08:17