作者feather2 (飛羽)
看板Biotech
標題[求救] acetone/methanol沉澱蛋白回溶
時間Fri Apr 26 23:30:57 2019
小弟我進行植物的蛋白以TCA/Acetone方法沉澱蛋白
以８Ｍ GnHCl+Hepes 含有DTT等回溶一晚
進行化學修飾之後再進行一次8x Acetone/1x methanol沉澱 3小時 -80度
以methanol洗兩次之後 過程中離心14000g 20 min
第一次風乾pellet 1小時 pellet半透明 有點黃
我依照文獻用極小量的50mM NaOH再加入HEPES buffer
一直vortex 很難溶 留有很多塊狀pellet 因為很多文獻都說不可以太乾
但是沒有說怎麼樣叫太乾 會很難溶
第二次 我依照不同乾燥時間去回溶 在第20min時pellet縮小 有點黃
第30min時 pellet有點片狀 有點透明
第35min時 pellet有點硬
第40分鐘時 pellet明顯很硬
在35分鐘以前的狀態 我加入NaOH後都可以很快地把pellet變成乾燥前那種白色疏鬆的狀態
加入buffer後也可以變成沒有塊狀體的混合液
但是無法真的溶解
離心後還是白色粉狀沉澱 上清液定量後的濃度很低
想請問大大們 應該要乾到什麼程度
回溶時應該怎麼操作 須不須要加熱 37度 50度 之類 vortex
或是將上清移除 加新的buffer如此重複 畢竟蛋白也有溶解度
或是一定要放過夜的時間長度
因為時間的關係非常希望不要隔夜 不然一周做不完
接下來的過程要處理trypsin等等 無法使用Urea和DTT來幫助溶解
希望有高手可以指教 不知道大家的回收率是多少?
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1F：→ feather2: 文中的第一次和第二次都是指後面的acetone/methanol操作 04/26 23:33
2F：→ Ianthegood: sonication? 04/27 00:21
3F：推 joseph103331: 1% SDS + beta-mercap 95度作用應該可溶 04/27 01:51
4F：推 tynse71864: 之前TCA沉澱是 acetone洗完放hood 10分鐘就加 sample 04/27 02:59
5F：→ tynse71864: bfr煮10分鐘，會溶完; 但我的 pellet都米粒大小而已 04/27 02:59
6F：推 Ianthegood: 除非上2D不然我都寧願dialysis+amicon XD 04/27 03:50
7F：→ Ianthegood: sds應該比較強, 1%不夠就2%, 但是你的protein就肯定 04/27 03:51
8F：→ Ianthegood: 死光 04/27 03:51
9F：推 july81212: 你是要做 in solution digestion嗎 04/27 09:30
10F：→ july81212: 如果是不用再沈澱 直接稀釋到1M以下GnHCl就可以繼續了 04/27 09:30
11F：→ july81212: 高鹽狀況下直接用有機溶劑沈澱通常鹽也會一起析出建 04/27 09:30
12F：→ july81212: 議真的沒辦法就先desalt 在往後做沈澱 04/27 09:30
13F：→ feather2: 因為digestion後還要做一次化學真對NH2的修飾 這步驟要 04/29 11:18
14F：→ feather2: 去掉前一次修飾的填加物 就算dilute直接trypsin 勢必要 04/29 11:18
15F：→ feather2: 再沉澱一次 04/29 11:18
16F：→ feather2: 如果先dilute降低GnHCl再沉澱會否讓鹽不會一同沉澱 就比 04/29 11:20
17F：→ feather2: 較好溶 但是methanol不是應該把鹽都洗掉嗎? 04/29 11:20
18F：推 july81212: 這樣的話digestion 完用C18 desalt或是第一個修飾找看 04/29 22:35
19F：→ july81212: 看有沒有chemical 可以quenching (IAA可以用DTT)metha 04/29 22:35
20F：→ july81212: nols 造成的鹽析出會跟蛋白喇在一起 然後整塊硬掉 稀 04/29 22:35
21F：→ july81212: 釋是一個解可是稀釋後沈澱回收變比較低可以的話用其他 04/29 22:35
22F：→ july81212: desalt 放是比較好 04/29 22:35