作者feather2 (飞羽)
看板Biotech
标题[求救] acetone/methanol沉淀蛋白回溶
时间Fri Apr 26 23:30:57 2019
小弟我进行植物的蛋白以TCA/Acetone方法沉淀蛋白
以８Ｍ GnHCl+Hepes 含有DTT等回溶一晚
进行化学修饰之後再进行一次8x Acetone/1x methanol沉淀 3小时 -80度
以methanol洗两次之後 过程中离心14000g 20 min
第一次风乾pellet 1小时 pellet半透明 有点黄
我依照文献用极小量的50mM NaOH再加入HEPES buffer
一直vortex 很难溶 留有很多块状pellet 因为很多文献都说不可以太乾
但是没有说怎麽样叫太乾 会很难溶
第二次 我依照不同乾燥时间去回溶 在第20min时pellet缩小 有点黄
第30min时 pellet有点片状 有点透明
第35min时 pellet有点硬
第40分钟时 pellet明显很硬
在35分钟以前的状态 我加入NaOH後都可以很快地把pellet变成乾燥前那种白色疏松的状态
加入buffer後也可以变成没有块状体的混合液
但是无法真的溶解
离心後还是白色粉状沉淀 上清液定量後的浓度很低
想请问大大们 应该要乾到什麽程度
回溶时应该怎麽操作 须不须要加热 37度 50度 之类 vortex
或是将上清移除 加新的buffer如此重复 毕竟蛋白也有溶解度
或是一定要放过夜的时间长度
因为时间的关系非常希望不要隔夜 不然一周做不完
接下来的过程要处理trypsin等等 无法使用Urea和DTT来帮助溶解
希望有高手可以指教 不知道大家的回收率是多少?
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1F：→ feather2: 文中的第一次和第二次都是指後面的acetone/methanol操作 04/26 23:33
2F：→ Ianthegood: sonication? 04/27 00:21
3F：推 joseph103331: 1% SDS + beta-mercap 95度作用应该可溶 04/27 01:51
4F：推 tynse71864: 之前TCA沉淀是 acetone洗完放hood 10分钟就加 sample 04/27 02:59
5F：→ tynse71864: bfr煮10分钟，会溶完; 但我的 pellet都米粒大小而已 04/27 02:59
6F：推 Ianthegood: 除非上2D不然我都宁愿dialysis+amicon XD 04/27 03:50
7F：→ Ianthegood: sds应该比较强, 1%不够就2%, 但是你的protein就肯定 04/27 03:51
8F：→ Ianthegood: 死光 04/27 03:51
9F：推 july81212: 你是要做 in solution digestion吗 04/27 09:30
10F：→ july81212: 如果是不用再沈淀 直接稀释到1M以下GnHCl就可以继续了 04/27 09:30
11F：→ july81212: 高盐状况下直接用有机溶剂沈淀通常盐也会一起析出建 04/27 09:30
12F：→ july81212: 议真的没办法就先desalt 在往後做沈淀 04/27 09:30
13F：→ feather2: 因为digestion後还要做一次化学真对NH2的修饰 这步骤要 04/29 11:18
14F：→ feather2: 去掉前一次修饰的填加物 就算dilute直接trypsin 势必要 04/29 11:18
15F：→ feather2: 再沉淀一次 04/29 11:18
16F：→ feather2: 如果先dilute降低GnHCl再沉淀会否让盐不会一同沉淀 就比 04/29 11:20
17F：→ feather2: 较好溶 但是methanol不是应该把盐都洗掉吗? 04/29 11:20
18F：推 july81212: 这样的话digestion 完用C18 desalt或是第一个修饰找看 04/29 22:35
19F：→ july81212: 看有没有chemical 可以quenching (IAA可以用DTT)metha 04/29 22:35
20F：→ july81212: nols 造成的盐析出会跟蛋白喇在一起 然後整块硬掉 稀 04/29 22:35
21F：→ july81212: 释是一个解可是稀释後沈淀回收变比较低可以的话用其他 04/29 22:35
22F：→ july81212: desalt 放是比较好 04/29 22:35