作者IFN113 (CY)
看板Biotech
標題[求救] HEK293T IFA 問題及改善方法
時間Thu Mar 21 18:07:13 2019
(手機排版)
嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚
先感謝點進來的大大們
小妹壓力爆棚快往生了
老闆一直覺得為啥核比較大顆 (??)
為什麼沒辦法染出mitochondira 均勻分佈在細胞的樣子，老闆說要看到均勻分佈的美圖呀QQ
本lab目前沒有存在做過的人，小妹我也是自己摸索試看看，無人能討論故求板上大神們解救一下嗚嗚
以下為小妹做的方式
免疫螢光染色
1. 種細胞
取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 種於24mm圓玻片上培養16小時，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培養40分鐘
2. 固定細胞
以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定細胞 15 min 後wash PBS 兩次
3. 細胞打洞
配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well內5 min
4. Blocking
配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常溫搖晃1小時，
再用PBS buffer wash 3次
5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次
6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250)
以最低rpm搖1小時，再用PBS wash 2次
7. 取出玻片滴上含有DAPI封片膠後蓋於載玻片上周圍塗上指甲油固定封片
然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的
我有乖乖做Z-stack QAQ...
每次做到加triton時細胞都給我飄起來說hello..
(改0.1%也是)
我已經非常非常非常小心的加任何試劑了QQ…
我要怎麼做出細胞貼的好好，然後mitochondira均勻分佈的美圖咧QAQ
大大們可以幫小妹做個檢討嗎TAT
以下圖檔:
紅色：Mitotracker
>>MitoTracker™ Red CMXRos (Thermo)
綠色：目標protein
藍色：DAPI
http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg
謝謝!!!!!!!!
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1F：推 tynse71864: 玻片有先摳嗎 03/21 20:36
2F：推 tynse71864: 1. 293非常會飄，試試看玻片用 0.01%PLL摳一小時,他會 03/21 21:30
3F：→ tynse71864: 貼的比較好，自然不易被沖下來。 03/21 21:30
4F：→ tynse71864: 2. formaldehyde會用 PBS 之類的 bfr 稀釋吧？ 滲透壓 03/21 21:30
5F：→ tynse71864: 過高也會影響 fixation過劇而皺縮。 03/21 21:30
6F：推 tynse71864: 後來查了 mitotracker的建議，上述第二點就忽略吧! 可 03/21 21:41
7F：→ tynse71864: 以從第一點改善 03/21 21:41
8F：推 Ianthegood: 小弟跟動物細胞不熟, 2 formaldehyde的medium裡是有fb 03/21 22:59
9F：→ Ianthegood: s的嗎? 03/21 22:59
10F：推 Devilxxx: formaldehyde是拿來固定細胞的，有沒有fbs好像沒啥關係 03/25 20:52
11F：→ Devilxxx: ？ 03/25 20:52
12F：推 ChloeClark: 我自己的經驗是，雖然mitotrcke「號稱」對細胞沒有毒 04/26 07:37
13F：→ ChloeClark: 性，但事實上卻因細胞而異，我記得tracker也可以死染 04/26 07:38
14F：→ ChloeClark: （自己查一下），可以改成固定後跟抗體一起染，或者 04/26 07:38
15F：→ ChloeClark: 改用抗體抓粒線體，這樣圖會美一點，粒線體也較於呈現 04/26 07:38
16F：→ ChloeClark: 它原本的形狀。另外「粒線體均勻分佈在細胞中」，欸 04/26 07:38
17F：→ ChloeClark: 抖...有的細胞的粒線體是圍在細胞核附近的，你要不要 04/26 07:38
18F：推 s73121: 換細胞株做，293易漂，沒漂也容易在加入試劑時變圓，當然 06/14 22:08
19F：→ s73121: 細胞質區域就變少不容易觀察，若非得用293,那就先用poly-l 06/14 22:08
20F：→ s73121: ysine coating試試 06/14 22:08